Способ концентрирования биологических частиц Советский патент 1988 года по МПК G01N27/26 

00

:о

о

ел

15

20

Изобретение относится к биохимии И биофизике, в частности к технике разделения и концентрирования частиц, отличающихся по электрофоретической подвижности (ЭФП), таких как клетки, бактериофаги и макромолекулы.

Цель изобретения - повышение эфективности, сокращение времени концентрирования и расширение спектра Q концентрируемых частиц.

Буферные растворы должны иметь одновременно высокое значение рН и низкое значение электропроводности со стороны катода, а со стороны аноа низкое значение рН и высокое знаение электропроводности, иметь обий буферный ион. Кроме того, подвижность ионов анодного буфера должна быть выше, чем катодного и граница буферов должна иметь в электрическом поле постоянную скорость и не зменяться со временем.

В качестве катодного буфера исользуют трис-глициновый буфер рН8,9 25 удельной электропроводностью , 5 10 (30 г глицерина и г триса на 2 л дистиллированной воы) , а в качестве анодного буфера трис ацетатный рН 4,9 и удельной электропроводностью 1,1 (6 мл ледяной уксусной кислоты и 4 г триса на 2 л дистиллированной воы) . Для того, чтобы граница между буферами не размывалась из-за электроосмотических течений жидкости в электрическом поле стеклянные стенки камеры предлагается обрабатывать 3%-ным раствором триэтилсилана в тоуоле для снижения поверхностного потенциала стенок.

Скорость смещения границы используемых буферов от минуса к плюсу при плотности тока 0,1 А/см и времени нахоткдения растворов в электрическом поле 70 с составляет 0,012 см/с. Для увеличения эффективности использования рабочего объема концентратора используется гидродинамический поток буфера, направленный навстречу движения границы от плюса к минусу. Поток 50 буфера формируется отдельным перистальтическим насосом.

Пример 1, Концентрирование кофеина (вещество дмолекулярной массой 194,2 дальтон и близкий к нулю 55 электрофоретической подвижностью).

Концентрирование проводят в проточной электрофоретической камере

иг Ом

30

35

40

45

0

5

0

5

0

5

0

5

концентрирования рабочим объемом 250x50x1 мм, с равным числом каналов (на входе и на выходе по 48), Расстояние между соседними каналами по 1 мм. С 1 по 28 канал, считая от катода, подают раствор кофеина оптической плотностью 0,2 на длине волны 280 нм, концентрацией 10 г/мл в трис-глициновом буфере рН 8,9 удельной электропроводностью 0, . В 29 по 48 канал подают трис- ацетатный буфер рН 4,9 и удельной электропроводностью 1, 1 . Эксперименты проводят при постоянном токе О,1 А и охлаждении буфера до 7°С.

Скорость потока буфера 0,35 см/с соответствует среднему времени нахождения концентрируемого образца в камере порядка 70 с. Скорость бокового смещения буфера 0,01 см/с, что соответствует 0,025 см /с производительности насоса смещения.

Концентрация вещества в пике превосходит исходное значение в 12,5 раз при производительности 412 мл раствора кофеина в 1 ч.

П р и м е р 2. Концентрирование гемоглобина крупного рогатого скота (белок молекулярной массы 1,710 дальтон и высокой электрофоретической подвижностью). Для концентрирования белка используют аналогичные, как описано в примере 1, буферные растворы и режимы концентрирования. С 13 по 48 канал, считая от анода, подают раствор белка концентрацией 2,510 мг/мл, что соответствует оптической плотности 0,05 на длине волны 280 нм в кювете толщиной 10 мм, Концентрация гемоглобина в пике превышает исходное значение в 10 раз.

Предлагаемьш способ имеет процесс концентрирования непрерывный, производительность 400 мл и вещества и позволяет концентрировать более широкий спектр биологических частиц от клеток до ионов независимо от изо- точки.

Форму л,а и 3 о бретения

Способ концентрирования биологических частиц путем проведения электрофореза в ступенчатых градиентах рН, отличающийся тем, что, с целью повьш1ения степени концентрирования, экспрессности и расширения

313905604

спектра концентрируемых частиц, био-раствор, имеющий максимальное значе- логические частицы непрерывно вводятние рН и минимальную величину элек- в несущий буферный раствор, имеющийтропроводности, а положительно заря- ступенчатое распределение электро-женные биологические частицы вводят проводности, причем отрицательнов анодную область с буферным раство- эаряженные биологические частищ- вво-ром, имеющим минимальные величины дят в катодную область в буферныйрН и электропроводности.

Изобретение может быть использовано в препаративной биохимии и биотехнологии для научно-исследова- тельских работ и в промьшшенном производстве особо чистых биологически активных препаратов. Цель изобретения - сокращение времени, повышение эффективности концентрирования и расширение спектра концентрируемых веществ. Цель достигается путем неf прерьшного ввода суспензии биологических частиц в несущий слой буфера со стороны катода со ступенчатым градиентом электропроводности, имеющим в 2-5 раз более высокое значение электропроводности у анода, чем у катода. Боковое смещение ступеньки градиента от анода к катоду происходит со скоростью 0,01-0,03 см/с. сл с