Изобретение относится к ферментной промышленности, в частности к получению фибринолитических ферментов. Известны способы получения фибринолитического фермента путем культивирования его продуцентов на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением фермента из культуральной жидкости. Предлагае.мый способ позволяет получить более активный фермент. Для этого в качестве продуцента используют штамм Streptomyces venetus DS 24288 (NRRL) 3987. Способ получения фибринолитического фермента, названного «Энзим 22750 RP, заключается в том, что микроорганизм Streptomyces venetus DS 24288 или его мутанты выращивают поверхностным или глубинным методом в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли, стимуляторы роста, сгустители. Перед выращиванием только штамма в производственном ферментере готовят посевную культуру по следующей схеме: хранение- выращивание вначале на агаре, затем во встряхиваемой колбе и в ферментере для получения инокулума. В качестве ассимилируемых источников углерода могут быть использованы углеводы, такие как глюкоза, сахароза, лактоза, декстрины, амидон, меласса или другие насыщенные углеводородами вещества, такие как сахарные спирты, например глицерин или манит, или некоторые органические кислоты: молочная, лимонная, винная. Некоторые животные или растительные масла, например масло шпига или соевое, могут с успехом заменить углеводородные источники или служить добавками. В качестве источника азота могут быть использованы простые химические вещества, например нитраты, минеральные соли или органические соли аммония, мочевины, аминокислоты, а также сложные вещества, содержащие в основном азот в виде протеидов - казеин, лакталебумин, глутен и их гидролизаты, соевая мука, арахидовая мука, рыбная мука, мясной экстракт, дрожжевой экстракт, отходы пивоваренной промышленности, кукурузный экстракт. Среди дополнительных неорганических элементов некоторые могут иметь действие буферного раствора или нейтрализатора, например щелочные или щелочноземельные фосфаты или карбонаты кальция или магния. В среду могут быть введены вещества, которые вносят необходимое ионное равновесие в развитие Streptomyces venetus DS 24288 и накопление фермента. Такими являются хлориды и сульфаты щелочных или щелочноземельных металлов. Некоторые являются активаторами метаболических реакций Streptomyces venetus DS 24288, например соли железа, кобальта. Что касается сгустителей, то обычно используются амидон, карбоксиметилцеллюлоза, агар. Вначале выращивания рН среды устанавливают 6,0-7,8, предпочтительно 6,4-7,5. Выращивание осуществляют при температуре 23-40°С (25-28°С является оптимальной) в течение 1-7 дней. Наиболее удовлетворительный процесс ферментации осуществляется при аэрации 0,3- 2 л воздуха на 1 л/мин среды. Энзим 22750 RP может быть выделен из ферментационного сусла и очищен с применением обычных методов выделения и фракционирования белковых материалов, при этом активность и степень чистоты продукта контролируется соответствующими способами, например определением активности на казеине и электрофорезе. Энзим 22750 RP может быть выделен из ферментационной среды фильтрованием последней в присутствии фильтрационной добавки, фильтрат концентрируют при приведенном давлении, подкисляют при рН, близком к 4, вновь фильтруют, диализуют потоком дистиллированной воды, затем осаждают фермент добавлением ацетона в диализат. Фермент энзим 22750 RP, полученный гаким образом, может быть затем очищен с использованием обычных физико-химических методов. В .частности, применяемые методы очистки, заключаются в растворении фермента в дистиллированной воде, с последующим осаждением при добавлении агентов, в водных концентрированных растворах которых фермент малорастворим, например в средних солях. Фермент может быть очищен хроматографией на различных основах, например алюминии, целлюлозе в порошке, гелях декстрина или полиакриламида, диализом или подготовительным электрофорезом. Фермент, полученный по данному способу, имеет следующую физико-химическую характеристику. Он очень легко растворяется в воде, в водно-спиртовых и водно-ацетоновых смесях, малорастворим в концентрированных растворах нейтральных солей (NaCl; (NH4)2SO4) или полиэтиленгликоле и нерастворим в безводных спиртах, ацетоне, гексане, этилацетате, эфире и хлорированных растворителях. Фермент 22750 RP является протеином, вступающим в классические для протеина реакции (биуретовая реакция, реакция Фолина, окращивание красным Нонсо, черным амидом 12 BN или голубым Гомасси). Фермент содержит углерод, водород, кислород, азот и серу. Его элементарный состав следующий, %; С 50,4; Н 7,35; N 17; S 0,50. Нри проведении хроматографии на геле декстрана или геле полиакриламида молекулярный вес фермента равен 40 000±5000. Проведение кислого гидролиза фермента энзим 22750 RP позволяет выявить следующие аминокислоты, на 10 г продукта ммоль: аспарагиновая кислота 11,6, треонин 8,5, серин 7, глутаминовая кислота 3,5, пролин 2,5, глицин 13, аланин 7, валин 4,5, метионин 1, изолейцин 2,5, лейцин 4, тирозин 5, фенилаланин 2, лизин 3, аргинин 2,5 и гистидин 2. Физические свойства фермента следующие. Внешний вид: белый порошок (после лиофилизации) УФ-спектроскопия (определение из раствора в воде 0,03%): абсорбция 210 нм; EicM 187; минимальная абсорбция 250 нм; KICM 4,35; максимальная абсорбция 278 нм; EjcM 13,35. ИК-спектроскопия (определение на таблетках в смеси с КВЧ). На фиг. 1 изображен спектр, на котором по оси абсцисс с одной стороны отложены длины волн, мк (высшая шкала), с другой стороны число волн, (низшая шкала), на оси ординат представлена оптическая плотность; на фиг. 2 дана диаграмма результатов, полученных с применением фермента энзем 22750 RP. Указанный спектр изображен на рис. 3, по абсциссе с одной стороны отложена длина волн, мк (верхняя шкала), с другой стороны число волн, (нижняя шкала), и на оси ординат представлена оптическая плотность. Основные полосы поглощения для данного продукта следующие. Вращательная способность: (определение на растворе 0,5%-ном в воде). а 2 -14+0,5°; ,2+0,6°; Н -53,5+0,8°; Фермент 22750 RP можно также отличить по его поведению при электрофорезе на геле цетатцеллюлозы при использовании различных буферных растворов: имонная кислота- вто- рН 2,2; мк 0,09 ричный фосфат натрия ксусная кислота - аце- рН 4,0; мк 0,1 тат натрия иэтил - 5,5 - барбитуро- рН 8,6; мк 0,075 вая кислота (барбитал) дкий натр - глицин рН 9,6; мк 0,1 мк-ионная сила Индикация может быть осуществлена колоиметрическими методами или измерением на ротеолитическую активность. Например, при рН 4,0 активный фактор пеемещается к катоду, происходит перемещеkHe 5 мм/2 час, при постоянном напряжении, равном 250 в (интенсивность изменяется от 6 до 15 ма).
Фермент оказывает влияние на большое число субстратов, носящих белковый характер и, в частности на казеин, гемоглобин, фибрин. Очень незначительное воздействие оказывает на этиловый эфир бензоиларжинина (ВАЕЕ) и абсолютно не влияет на этиловый эфир ацетилтирозина (АТЕЕ).
Воздействие на казеин определяется в соответствии с методом Кунитца, применяемой при дозировке трипсина.
Растворимые в трихлоруксусной кислоте пептиды, освобожденные во время гидролиза.
измеряются спектрофотометрией (измерение оптической плотности при 280 им). Энзиматическая активность может быть выражена в единицах Кунитца (У, К). В соответствии с определением Кунитца, одна единица составляет количество энзима, который освобождает достаточное количество растворимых пептидов для того, чтобы оптическая плотность при 280 нм трихлоруксусного фильтрата возрастала до 1,000 в минуту.
В табл. 1 представлены результаты, полученные с применением фермента 22750 RP в сравнении с двумя протеолитическими кристаллизованными энзимами: трипсином и химотрипсином.
Таблица 1
Тромболитическая и фибринолитическая активность подтверждена испытаниями на лабораторных животных.
При дозе 0,5 мг/кг, введенной внутривенно, фермент 22750 RP весьма значительным образом предохраняет кролика против виутрисосудистой коагуляции, возникающей при проходе по шейной вене нейлоновой нити, импрегнированной коллагеном. Ускорение фибринолиза может быть выявлено у кролика при дозе 0,05 мг/кг, введенной внутривенно.
Токсичность фермента 22750 RP изучена на многих видах животных. У мыши летальная доза определена при введении внутривенно 50% (ДЛзо): она составляет 5 мг/кг; доза одна и та же при повторяющемся введении в течение 5 дней и при одноразовом введении. У кролика ДЛбо, введенная внутривенно, составляет 1,5 мг/кг.
Благодаря таким свойствам фермент, полученный предлагаемым способом, можно применять в терапии для профилактики и лечения венозных тромбов, легочной закупорки
сосудов, тромбозов венечных артерий, артерий конечностей и мозговых артерий.
Микроорганизм - продуцент фермента 22750 RP - принадлежит к Streptomyces venetus DS 24288 (NRRL 3987).
Продуцент выделен из образца почвы, привезенной из Индии.
Выделяют Streptomyces venetus DS 24288 по известной методике. Согласно последней в стерильную дистиллированную воду вводят
небольшое количество почвы. Из полученной суспензии готовят пробы различной концентрации. Затем небольшой объем из каждой пробы наносят на поверхность питательной среды с агаром, находящейся в чашке Петри. Осуществляют выращивание колоний на поверхности среды в течение нескольких дней при температуре 25°С. Затем некоторые колонии изолируют и пересаживают на питательный агар - агар, находящийся в наклонном положении, для получения более обильных культур. Streptomyces venetus DS 24288 образует овальные споры размером 0,4-6 мк (чаще 1-1,2 мк). Спорофоры содержат спиральные нити, Которые наматываются в 5-8 оборотов, но иногда превосходят это число. Часто встречаются спорофоры, располагающиеся на нитях, которые их держат, встречаются также спорофоры гроздями из нескольких элементов. По своей манере споруляции это начальное звено можно отнести к классу Spira классификации Придхама. Streptomyces venetus DS 24288 хорошо развивается при температуре 25°С и 37°С, плохо при температуре 50°С. Он обладает способностью производить черный меланиновый пигмент в среде, нодходящей для тирози)1а. Штамм образует H2S. Нитраты восстанавливают в нитриты. Гидролизует амидон. Желатин сжижаег. Молоко пептонизирует без предварительной коагуляции. Использует целлюлозу. Окрашивание мицелиума происходит поэтапно, в зависимости от среды, в которой он находится: от желтого к желто-коричневому, коричнево-желтого или темно-коричневого. Растворимые пигменты, которые он производит, имеют обычно коричнево-желтый тон, более или менее темный, в зависимости от среды, в некоторых случаях цвет может быть коричнево-черным. При наступлении споруляции его воздушный мицелиум окрашивается в голубой цвет. Культуральные и биохимические свойства Streptomyces venetus DS 24288 собраны в табл. 2. Представлены культуры, имеющие удовлетворительную стадию развития, т. е. выращенные в течение трех недель при 25°С. Качества продукта подвергнуты исследованию на питательных агарах и бульонах, которые обычно применяются для определения морфологической характеристики рода Streptomyces. Выращивание на твердых средах проводилось на агарах в наклонном состоянии. Некоторые среды приготовлены по формулам, указанным в «The Actinomycetes, А. О. Ваксман, стр. 193-197, «Chronica Sotanica Company, Waltham. США, 1950. В этом случае эти среды обозначены в табл. 2 буквой В с номером, который был ей присвоен в «The .Actinomycetes. Streptomyces venetus DS 24288 обладает признаками, которые точно не совпадают ни с одной характеристикой культур, ранее описанных и использованных в качестве основы. Фермент 24288 занимает место в известной серии Viridochromogenes, при этом принимаются во внимание его свойства производить меланиновый пигмент, обнаруживать воздушный спорулированный мицелий голубого цвета, растительный мицелий от светло-коричневого до темно-коричневого цвета, образовывать растворимые пигмепты от желто-коричневого цвета до коричнево-желтого или очень темного коричневого, в зависимости от среды (органической или синтетической), и представлять собой спиральные спорофоры. Он не может быть приравнен ни к одному из трех видов, на которые ссылается А. О. Ваксман, и составляющие эту серию, а именно: Streptomyces Viridochromogenes, Streptomyces chartrensis и Streptomyces cyanens. С одной стороны, он не может быть отождествлен с Streptomyces cyanens, который образует на агаровых средах растительный мицелий, окрашенный в голубой цвет, этого никогда не происходит с ним; кроме того, в противовес S. venetus DS 24288, S. cyanens не использует целлюлозы и не восстанавливает нитраты в нитриты. С другой стороны, он не Jмoжeт быть отождествлен с S. chartrensis, который дает растворимый пигмент зеленовато-желтого цвета к черному на желатине и не дает растворимого пиг.мента на питательном агаре и картофеле, в то время как S. venetus DS 24288 дает растворимый пиг.мент коричнево-желтого цвета на желатине, а также на питательном агаре и черный растворимый пигмент на картофеле. Наконец, он существенно отличается от S. Viridochromogenes тем, что последний образует на некоторых средах растительный мицелий, имеющий оттенок очень темно-зеленого цвета, иногда даже зелено-черноватого (в частности, на нитрированном синтетическом агаре с сахарозой, на желатине и на питательпом агаре). S. venetus DS 24288 образует растительный мицелий, который во всех случаях имеет цвет от желто-коричневого до коричнево-желтого и не имеет никогда зеленого оттенка, он также никогда не производит растворимого пигмента темно-зеленого цвета. S. Viridochromogenes не восстанавливает нитраты в нитриты, в то время как S. venetus DS 24288 восстанавливает их быстро и активно, как в синтетических, так и в органических средах. А. О. Ваксман относит также к группе «Viridochromogenes некоторое число основных культур, описываемых Гозом и др. (Zur Klassifizierung der Actinomycetes, G. Fischer, Вена, 1958): сравнивая его с последними, которые составляют основную часть серии Gocrulescens, Гоза, S. venetus DS 24288 находился бы в последней группе, которая включает се основные культуры, среди которых растиельный мицелий на агаре с амидонминеральым азотом Гоза имеет темный цвет и вклюает только два вида: Actinomyces (Streptoyces) Viridochromogenes и Actinomyces (Streptomyces) coeruleofuscus, S. venetus DS 4288 отличается от вида S. viridochromogees тем, что мицелий последнего на некотоых средах имеет темно-зеленую окраску.
11
12
15
Кроме того, в описании, приводимом Гозом и др., следует отметить, что S. viridochromogenes производит также растительпый мицелий, принимающий темно-зеленый оттенок на молоке, на агаре с амидоном, на картофеле, на агаре с амидонминеральным азотом Гоза и не производит в последней среде растворимого пигмента. По сравнению с ним S. venetus DS 24288 не дает никакого растительного мицелия темно-зеленого цвета в указанных средах и производит растворимый пигмент коричнево-желтого цвета на агаре с амидонминеральным азотом Гоза. Образование растворимого нигмента темно-зеленого цвета на желатине, которое приводится Гозом для S. viridochromogenes, отсутствует для S. venetus DS 24288. S. venetus DS 24288 не может быть отождествлен с 8. cocruleofuscus, который в противоположность ему не восстанавливает нитраты и не использует целлюлозу. Кроме того, 8. соссточники углерода
Использование
D-рибоза
Положительное D-ксилоза L-арабиноза L-рамноза D-глюкоза D-галактоза D-фруктоза 1 -маниоза
Отрицательное L-сарбоза Положител ь ное Лактоза Мальтоза Сахароза
Положительное Трегалоза
Целлобиоза
Рафиноза
Декстрин
Отрицательное
Инулин Положительное
Амидон
Гликоген
Глицерин
Отрицательное
Эритриол Положительное
Адонитол Отрицательное
Дульцит Положительное
D-.маннит Отрицательное
D-сорбитол Положительное
Инозитол
Положительное,
Салицин но медленное
Пример 1. Получение фермента.
200 смЗ культуры Streptomyces venetus DS 24288 рысевают в колбу Эрленмейера и осувдестм.яют культивирова {ие при температуре
16
ruleofuscus не дает растворимого пигмента в агаровой органической среде и на картофеле, в то время как 8. venefus D8 24288 регулярно дает на всех испытываемых
средах органического происхождения растворимый пигмент коричнево-желтого цвета, а на картофеле дает растворимый пигмент черного цвета.
Способность 8. venetus DS 24288 использовать различные источники углерода и азота для обеспечения своего развития определена в соответствии с принципом метода Придхама и Готтлиба («J of Bacf, 56, 107-114, 1948). Степень развития наблюдалась на основной
среде, указываемой в предлагаемом изобретении, с заменой глюкозы различными источниками углерода, либо ()2804 различными источниками азота.
Результаты приводятся ниже.
сточники азота
Использование
NOjNa
Положительное NOsNa
(m,-),so,
(NH,)2HP04 Аденин Аденозин Мочевина L-аспаргин Гликоколль Саркозин
Отрицательное DL-аланин Положительное DL--валкн
L-аспарагиновая
Положительное кислота
L-глутаминовая кислота
L-аргинин|
L-лизин
DL-серин
DL-треонин
Таурин
Отрицательное
DL-фенилаланин Положительное L-тирозин DL-пролин L-гидроксипролин L-гистидин L-триптофан ретаин
26°С, перемешивании и аэрации в течение 28 час.
Выращенную культуру пересевают в фер ментер емкостью 170 л, содержащей стерильную охлажденную среду следующего соста600Пентон 600 Мясной экстракт глюкоза 1200 Гидратированная 120 смз Соевое масло 600 Хлористый натрий Вода дополнение до 110 л с рН 7,0. Перед стерилизацией рН среды устанавливают 7,5 добавлением 120 см 10 н. каустической соды. Стерилизацию среды осуществляют барботированием пара нри 122°С в течение 40 мин. 40 л культуры нолученной предыдущим выращиванием, вносят в ферментер емкостью 800 л, содержащей среду следующего состава, кг: Кукурузный экстракт (50% сухого экстракта)8 Соевое масло6 л Сульфат аммония0,8 Гексагидратированный хлорид кобальта0,008 Водадополнение до 360 л Перед введением культуры в указанную среду рН среды устанавливают на значении, равным 6,4 добавлением 450 см 10 н. каустической соды, после чего вносят карбонат кальция в количестве 2 кг и стерилизуют барбатировацием пара при температуре 122°С в течение 40 мин и охлаждают. После охлаждения объем среды составляет 390 л. Объем среды доводят до 400 л добавлением 10 л водного стерильного раствора, содержащего 4 кг гидратированной глюкозы; рН среды становится 6,6. Выращивание осуществляют при температуре 26°С, перемещивании центрифугой, аэрации стерильным воздухом в объеме 35 в течение 116 час. В процессе выращивания рН среды устанавливается 6,8. Протеолитическая активность культуральной среды составляет 0,4 УК/см. Выделение фермента из среды. В 360 л среды ввели фильтрационную добавку, перемешивают и профильтровывают на фильтрпрессе. Полученный осадок промывают 100 л воды. В результате получают 400 л фильтрата с активностью фермента 0,35 УК/см. Фильтрат концентрируют при 3°С и получают 30 л концентрата с активностью фермента 3,77 УК/смЗ; рП концентрата устанавливают 4,0 добавлением 450 слг 6 н. соляной кислоты и затем вводят 300 г фильтрующей добавки. Отфильтровывают, полученный осадок промывают 2 л воды. Осветленный концентрат охлаждают до 4°С, продиализовывают через мембрану из регенерированной целлюлозы в течение 7 час с противотоком дистиллированной воды при той же темпеоатуре. В приготовленный таким рбразом растзор медленно добавляют при еремешивании 9,6 кг кристаллического сульата аммония (количество, вычисленное для олучения раствора с 30%-ным насыщением соли), перемешивают в течение 20 мин, затем тделяют осадок центрифугированием, а в фугат при перемешивании добавляют 5 кг ристаллического сульфата аммония (количество, вычисленное для получения 52% насыщения), перемешивают в течение 15 мин, полученный раствор выдерживают 15 мин и центрифугируют. Собирают полученные осадки, добавляют 1 л дистиллированной воды и раствор подвергают диализу через мембрану из регенерированной целлюлозы в течение 24 час при 4°С в противотоке с 40 л дистиллированной воды. Диализат лиофильно сушат. Получают 70 г фермента активностью 1200 УК/г. После анализа на электрофорезе установлено, что он содержит около 13% активного фактора. Очистка фермента. Полученный вышеуказанным методом фермент растворяют в 4100 см дистиллированной воды, рН раствора устанавливают 8,0 введением 66 см каустической соды. В полученный таким образом раствор медленно вводят при перемешивании 1,25 кг полиэтиленгликоля 1500, перемешивают еще в течение 15 мин. Раствор оставляют на 15 мин, затем центрифугируют при температуре 4°С. Активный осадок вводят в 700 см дистиллированной воды и полученный раствор (800 см) охлаждают до 4°С. При перемешивании в раствор вводят 4 л изопропанола, охлажденного до -60°С. Собирают активный осадок центрифугированием, затем сушат при приведенном давлении (0,2 мм рт. ст.) в присутствии Р2О5 при температуре, близкой к 20°С Таким образом, получают 30,7 г продукта с активностью 1600 УК/г, содержащего после проведения анализа на электрофорезе около 20% активного фактора. 10 г продукта, полученного при таких же условиях, вводят в 400 см дистиллированной воды, и рН раствора устанавливают 8,0 добавлением 3 см каустической соды. В раствор меллеппо добавляют при пepe тeIпивaнии 26,6 см водного 6%-ного раствора лактата диамино-6.9-этокси-2-акридина. После дополнительного переметиивания в течение 15 мин и 1 час отстоя центрифугируют в течение 0 мин при 12000 g и температуре 4°С. Неактивный осадок, полученный таким образом, удаляют, а фугат концентрируют при давленщ 0.2 мм рт. ст. и температуре 25°С до объема 25 см. Затем раствор охлаждают до 4°С при перемещивании и добавляют 250 см изопропапола, охлажденного до -60°С. Полученный активный осадок собирают центрифугированием в течение 15 мин при 12000 ,f и температуре -10°С, затем сушат при давлении 0,2 мм рт. ст. в присутствии Р2О5 и . Получают 4,7 г продукта с активностью 2240 УК/г, содержащего после проведения электрофоретического анализа около 37% активного фактора. 200 мг, приготовленного в указанных выше условиях продукта, добавляют в 3 см фосфатного буферного раствора 0,01 М с рН 6,5, 3 см изопропанола и 4 г целлюлозы в порошке для хроматографического анализа. Полученную таким образом пасту помещают ровным толстым слоем па верхушку целлюлозной колонки диаметром 3 см, содержащей 80 г целлюлозы в смеси объема к объему изопропанола и буферный фосфатный раствор 0,01 М с рН 6,5 (высота 39 см). Добавляют буферную смесь фосфат - изопропанол, увеличивая линейное содержание буферного раствора в смеси от 50 до 100% в объемах (общий объем элюента с градиентом композиции составляет 1,5 л); расход 35 . Элюат собирают фракциями примерно по 20 см и измеряют оптическую плотность непрерывно при помощи анализатора «УВИКОРД Л.К.В. при 280 нм. Полученная диаграмма имеет первый очень асимметричный пик, затем па расстоянии второй симметричный пик, соответствующий концентрации буферного раствора 78-92%. Электрофоретический анализ показывает, что второй пик содержит активный фактор. Собирают фракции, соответствующие второму пику (фракции 53-70°С, около 415 см), затем удаляют спирт выпариванием при давлении 2 мм рт. ст.. затем проводят диализ через мембрану из регенерированной целлюлозы с противотоком 10 л дистиллированной воды в течение 24 час при 4°С и сушат лиофильно. Таким образом, получают 43 мг продукта с активностью 6200 УК/г и в соответствии с электрофоретическим анализом, содержащим примерно 55% активного фактора. Пример 2. Зг продукта активностью 1600 УК/г, полученного при условиях, описанных в примере 1, растворяют в 40 см буферного барбиталового раствора с рН 8,6 мк 0,0375 и этот раствор подвергают диализу через мембрану из регенерированной целлюлозы в течение 48 час с противотоком 10 л того же буферного раствора при 4°С. Раствор осветляют центрифугированием в течение 15 мин при 12000 g и температуре 4°С, затем наносят на верх колонки для подготовительного электрофореза, содержащей 1,3 кг целлюлозы в барбиталовом буферном растворе с рН 8,6, мк 0,075 (что дает высоту 66 см). Затем подают напряжение 500 в (анод вверху); сила тока 0,46 а; температура внутри колонки 20°С. Эту температуру поддерживают циркуляцией в двойной стенке охлаждающей жидкости при 4°С. По истечении первого часа электрофореза окрашенные примеси переходят в анодный отсек. Окрашенный буферный раствор отделяют и заменяют свежим раствоpo f, Эту бперйЦИЮ повторяет несколько раз. Удаление пигментов достигнуто почти полностью по истечении 6 час электрофореза. Затем напряжение снижают до 400 в (1 0,32 а) и в нижней части колонны проводят элюирование при расходе 250 противотоком. Элюат собирают фракциями примерно по 50 см п определяют оптическую плотность непрерывно при помощи апализатора при 280 нм. По истечении 15 час такого режима напряжение повышают до 500 в (1 0,40 а) и скорость алюирования противотоком 125 . Через 10 час после начала операции электрофорез прекращают. Затем в колонку сверху вливают барбиталовый буферный раствор из расчета 210 . Полученная диаграмма представляет первый маленький пик (к 23 час электрофореза), затем три больших пика, находящихся на значительном расстоянии друг от друга. Электрофоретический анализ показывает, что только в третьем пике содержится активный фактор. Группируют фракции, соответствующие указанному третьему пику (около 1425 см), концентрируют до 400 см выпариванием при давлении 2 мм рт. ст., затем трижды диализуют в течение 24 час каждый раз с 50 л дистиллированной воды при температуре 4°С. Диализовапный раствор концентрируют до 10 см выпариванием при давлении 2ммрт. ст., затем охлаждают до 4°С. В раствор при перемешивании медленно добавляют 100 см изопропанола, охлажденного до -60°С. Собирают активный осадок центрифугированием в течение 10 мин при 12000 s и при -10°С, затем сугпат при давлении 0,2 мм рт. ст. в присутствии и температуре 20°С. Таким образом, получают 276 кг продукта с активностью 7000 УК/г и содержащего в соответствии с электрофоретическим анализом около 65% активного фактора. Продукт содержит углерод, водород, кислород, азот, фосфор и серу. Его состав по элементам близок к следующему, %; С 44,0; Н 6.5; N 12.5; Р 0.35; S 0.65. Кислый гидролиз позволяет выявить следующие аминокислоты с содержанием на 10 г продукта, ммоль: аспарагиновая кислота 8,5, треопип 7, серин 6.5. глутаминовая кислота 5, пролин 2, глицин 10,5, аланин 7.5. валин 5,5, изолейцин 2. лейцин 3, тирозин 3,5, фенилаланин 1, лизин 2, аргинин 2 и гистидин 1,5. Он обладает следующими физическими свойствами. Внешний вид -бежевая пудра (после лиофилизации). УФ-спектроскопия (определение по 0.02%ному раствору -в воде): абсорбция при 210 нм; 1 205; минимальная абсорбция при 250 нм; Б{°С„ 7,8; максимальная абсорбция при 278 нм; ЕГсм 14,1. ИК-спектроскопия (определение по таблет кам р смеси с КВЧ), Ниже даются основные полосы ИК-абсорбции для нродукта. Вращательная способность: определение по раствору концентр а цпей 0,5% в воде;5
Реакция ротеолиз
ибринолиз Эстеролиз
Пример 3. 22,8 г продукта, полученного при условиях по примеру 1 с активностью 2400 УК/г, добавляют в 480 см дистиллированной воды; рН раствора равен 7,4. Последующие операции проводятся при температуре + 4С.
Раствор наносят сверху целлюлозной колонны диаметром 15 см, содержащей целлюлозу, импрегнированную дистиллированной водой на высоте 17 см. Оптическую плотность элюата измеряют непрерывно при помощи анализатора при 280 нм. Полученная диаграмма представляет собой асимметричный пик, содержащий энзим, в то время как следы диамино-6,9-этокси-2-акридина, содержащегося в продукте, остаются на целлюлозе. Элюат, соответствующий абсорбирующ,им фракциям, собирают (например, 6,9 л) и концентрируют при температуре, не превышающей 25°С, при давлении 2 мм рт. ст. до 480 см.
475 см предыдущего концентрата разбавляют 205 см изопропанола, охлажденного до -10°С, и полученный раствор наносят сверху колонны из целлюлозы, импрегнированной смесью изопропанола и воды, содержащей 30 об.% спирта. Колонна диаметром 15 см содержит 600 г сухой целлюлозы (высота целлюлозы 7 см). Добавляют ту же смесь из расчета 450 и измеряют непрерывно оптическую плотность элюата на 280 нм. Элюат собирают фракциями по 20 см. Полученная диаграмма представляет собой асимметрические пики. После прохождения второго пика (около 10 л элюата) пропорция воды линейно возрастает до 100% в смеси (общий объем элюента с градиентом композиции примерно 22,5 л), затем разбавляют дистиллированной водой до получения фракций, поглощающих не более 280 нм (например, около 16 л). Последний абсорбирующий пик, разбавленный водой, находится между фракциями 950 и 1150,
Эти фракции собирают (примерно 11,6 л), концентрируют при давлении 2 мм рт. ст, до объема 150 см , затем сушат лиофи,дьно,
Активность (УК/г)
Вещество
Казеин
7,000
азо-Казенн 15000 1000
Желатин
Сгусток бычьего фиб2500рина
Сгусток плазмы кролика
4100 200000 Сгусток плазмы саба к и
ВАЕЕ
3000 АТЕЕ 500
Таким образОМ, получают 4,5 г продукта с активностью 6400 УК/г и содержащего по электрофоретическому анализу около 60% активного фактора. 1,5 г продукта, полученного при вьпиеописанных условиях и с 6400 УК/г, растворяют в 15 см раствора хлорида натрия 2 , охлажденного до +4°С. Раствор наносят сверху колонны биогеля Р 60, диаметром 7,5 см, уравновещенной тем
же растворителем при и содержащей набухший гель на высоте 122 см (что соответствует примерно 280 г сухого геля). Элюируют тем же растворителем из расчета 120 . Элюат собирают фракциями примерно по 35 см и измеряют его оптическую плотность непрерывно при помощи анализатора при 280 нм. Полученная диаграмма представляет собой симметричный пик с выступом в основной части при начале элюирования, что доказывает наличие абсорбирующей примеси.
Абсорбирующие фракции соединяют, удаляя примеси соответствующие элюированной до элюирования основного продукта, т. е.
фракции 65-80 (например 580 см); концентрируют при давлении 2 мм рт. ст, до объема 100 см и лиофилизируют.
Таким образом, получают 387 г продукта с активностью 11000 УК/г и содержаихего по
электрофоретическому анализу только белковый препарат fболее 95% активного фактора) .
Предмет изобретения
Способ получения фибринолитического фермента путем культивирования его продуцентов, на питательной среде, содержащей источНИКИ углерода, азота и минеральные соли, с последующим выделением фермента из полученной культуральной жидкости, отличающий с я тем, что, с целью повышения активности (Фермента, в качестве продуцента используют Streptomyces venetus DS 24288 (NRRL 3987). -10,3+0,3°; -17,7±0,3 Активность продукта на различные вещества приведена ниже: 4 5 -1111111 WO ma 2000mo
2275U ЯР
+ Трипсин
0 )(UMOmpUt1CUH
9
. .
-f
L,-,-L7 8
i / 4 ...-/ 3 W15 20 50 50 11111111r woo500 CM
мк 2,55
fl
0,20,. 0,В
15 20 30 50 If
8 9 10
t I I I I
woo
2000
ftOOd
1500WOO
Фиг. 5
