Способ получения экзотоксинсодержащего препарата из раствора Советский патент 1993 года по МПК A01N63/00 

Изобретение относится к области биотехнологии и может быть использовано при производстве экзотоксинсодержащих биологических препаратов -ч средств защиты растений,

Производимые в настоящее время экзо- токсинсодержащие препараты типа биток- сибациллина характеризуются низким 0,2-0,4 вес,% содержанием основного энто- мопатогенного агента - экзотоксина. Для повышения его содержания был предложен способ, в соответствии с которым спорокри- сталлический комплекс и остатки питательной среды отделяются центрифугированием (фильтрацией), экзотоксин переводится в осадок гидроксидом кальция, осадок отделяется центрифугированием (фильтрацией) и высушивается.

Такой способ имеет ряд недостатков, основными из которых являются неполное осаждение экзотоксина гидроксидом кальция, что приводит к его потере более 50 %. Использование гидроксида кальция усложняет способ и ведет к увеличению стоимости препарата за счет технологических затрат.

Целью настоящего изобретения является снижение себестоимости единицы веса препарата.

Поставленная цель достигается тем, что:

- нерастворимые в воде остатки питательной среды и присутствующие в растворимом состоянии высокомолекулярные соединения удаляются с помощью ультрафильтрации культуральной жидкости на мембранах с размерами пор по пропусканию белков с молекулярным весом (5000- 10000) Да;

- рН фильтрата доводят до 4,5-5.5, упаривают до концентрации экзотоксина (2,4- 4,8) г/л и выпавший осадок отделяют ультрафильтрацией на мембранах с разме ч О

го

ON Ы

ром пор по пропусканию белков с молекулярным весом (5000-10000) Да.

Сущностью данного способа является применение ультрафильтров с размером пор по пропусканию белков с молекуляр- ным весом (5000-10000) Да, что дает возможность очистки экзотоксина от сопутствующих высокомолекулярных веществ с минимальными потерями.

Способ заключается в том, что примене- ние мембран с размером пор по пропусканию белков (5000-10000) Да позволяет повысить содержание экзотоксина в препарате с минимальными потерями.

Упаривание экзотоксина при рН 4,5-5,5 до концентрации экзотоксина (2,4-4,8) г/л позволяет очистить экзотоксин от балластных веществ, прошедших через мембрану (нуклеотиды, пептиды и т.п.), повторной ультрафильтрацией.

П р и м е р 1. Культивирование микроорганизмов Вас. thuringiensls штамм 98-1с проводили в ферментаторе объемом 8 л на дрожже-полисахаридной питательной среде (ДПС) следующего состава, %: дрожжи кормовые 3,0 мука кукурузная 1,5 синтетический

пеногаситель0,08 при следующих условиях: температура

культивирования28-30 °С частота вращения

мешалки200-300 об/ми избыточное давление 0,4-0,5 атм расход воздуха 0,1 л/ч Содержание сухих веществ в полученной культуральной жидкости (КЖ) составляло 2,8 г/л, рН КЖ (6,0-0,5) ед. рН, а содержание экзотоксина 0,43 г/л,

После ферментации из КЖ удаляли остатки питательной среды методом тангенциальной фильтрации на ультрафильтрационных мембранах с различными размерами пор, в диапазоне (4500-0,1). Разделение проводили в следующих условиях:

скорость тангенциального потока(2,0-5,0) л/с температура КЖ (25+-S) °С трансмембранное давление (0,2+-0,02) МПА Потери экзотоксина (г/л) и его содержание (г/кг) в сухом концентрате после ультрафильтрации на мембранах с разными диаметрами пор показаны в табл. 1.

Экзотоксин, выделенный в виде фильтрата, упаривали до его содержания в концентрате фильтрата 2,4-4,8 г/л при рН 4,5-5,5, что позволило очистить экзотоксин от балластных веществ, прошедших через

мембрану (нуклеотиды, пептиды и т.п.), повторной ультрафильтрацией.

Данные представлены в табл. 2, где приведены потери экзотоксина (г/л) и его содержание (г/кг) в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от содержания экзотоксина в концентрате фильтрата (г/л).

Выбор допустимого измерения рН раствора выбран на основании данных, представленных в табл. 3, где приведено содержание (г/кг) экзотоксина в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от его рН.

Затем полученный фильтрат высушивали распылом, либо упаривали в 8-10 раз по объему. В первом случае предварительно в фильтрат добавляли фосфорнокислый аммоний (10% вес. по сухим веществам) в качестве диспергатора и клей КМЦ (5% вес. по сухим веществам) в качестве поверхностно- активного вещества. Концентрация экзотоксина в сухом препарате составила 3,9% вес. ЛК-50 на комнатной мухе - 0,006%. Во втором случае после упаривания в раствор добавляли 0,1% объема диметилсульфоксида (ДМСО) и 0,005% объема бриллиантового зеленого в качестве стабилизатора экзотоксина и консерванта и клей КМЦ (5% вес. по сухим веществам) в качестве поверхностно- активного вещества. Концентрация экзотоксина в жидком препарате составила 10 г/л (1 %). ЛК-50 на комнатной мухе - 0,01 %.

П р и м е р 2, Выращивание культуральной жидкости Вас. thuringiensis штамма 202-1 с проводили в ферментаторе объемом 8 л на поликомпонентной питательной среде (ППС) следующего состава, %:

дрожжи кормовые2,8 мука кукурузная 1,4 кальций хлористый 0,3 гидролизат шрота хлопкового 3,0 зеленая патока 1,0 синтетический пеногаситель 0,03 Культивирование проводили при условиях,, описанных в примере 1. Содержание сухих веществ в полученной КЖ составляло 2,2 г/л, рН(6,0+-0,5) ед. рН, содержание экзотоксина - 0,28 г/л.

Из полученной КЖ был получен экзотоксин в соответствии с условиями примера 1, данные представлены в табл. 4-6.

Потери экзотоксина (г/л) и его содержание в сухом концентрате (г/кг) после ультра- фильтрации на мембранах с разными размерами пор.

Потери экзотоксина (г/л) и его содержание (г/кг) в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от содержания экзотоксина в концентрате фильтрата (г/л).

Содержание (г/кг) экзотоксина в сухом концентрате после очистки фильтрата в зависимости от его рН,

Затем полученный фильтрат высушивали распылом, либо упаривали в 2-3 раза по объему и далее поступали так же, как и в первом примере. Концентрация экзотоксина в сухом препарате составила 3,5% вес. ЛК-50 на комнатной мухе-0,006%. Концентрация экзотоксина в жидком препарате составила 8 г/л (0,8%). ЛК-50 на комнатной мухе -0,1 %.

Содержание и потери экзотоксина измерялись с помощью тонкослойной хрома- тографии и спектрофотометрирования при длине волны 260 нм по способу (2). Ошибка измерений не превышала +-3%. ЛК-50 рассчитывалась по методу Кербера (3).

Расчет себестоимости единицы продук ции экзотоксинсодержащего препарата проведен на основании данных по стоимости оборудования, материалов, сырья.

0

5

0

5

Перечень оборудования, необходимого для получения экзотоксинсодержащего препарата, представлен в табл. 8, где приведены наименование и стоимость оборудо- вания, применяемого при получении экзотоксинсодержащего препарата.

Нормы расхода сырья и материалов для получения экзотоксинсодержащего препарата представлены в табл. 9,где показаны нормы расхода сырья и материалов на получение единицы веса экзотоксинсодержащего препарата

На основании приведенных данных видно, что отличие в затратах по получению сухих и жидких препаратов заключается в разных соответствующих расходах электроэнергии и материалов. С учетом этого можно подсчитать разницу в ценах единиц продукции препарата, полученного разными способами (см. табл. 10).

Таким образом, применение данного способа позволяет снизить себестоимость препаратов при сохранении его потребительских характеристик

Использование: биотехнология, производство экзотоксинсодержащих препаратов. Сущность изобретения: культивируют продуцент экзотоксина Bacillus thurlngiensls затем культу pa ль ну ю жидкость фильтруют для удаления остатков питательной среды и концен- трированияее с помощью ультрафильтрационных мембран с различными размерами пор 5000-10000 Да, затем в концентрате устанавливают рН 4,5-5,5,0 упаривают до содержания сухих веществ 2,4-4,8 г/л и повторно проводят ультрафильтрацию на тех же мембранах. 10 табл.

Формула изобретения

Способ получения экзотоксинсодержащего препарата из раствора путем концен- трирования, отличающийся тем, что, с целью снижения себестоимости целевого продукта, концентрирование осуществляют

ультрафильтрацией на мембранах с размером пор по пропусканию белков с мол. м. 5000-10000 Да, в полученном концентрате рН устанавливают 4,5-5,5, затем концентрат упаривают до содержания экзотоксина 2,4-4,8 г/л и повторно проводят ультрафильтрацию на вышеуказанных мембранах.

Таблица 1

Примечание. Размер пор мембраны равен 10000 Да, рН фильтрата 5,0.

Примечание. Степень концентрирования равна 10, размер пор мембраны 10000 Да

Таблица 2

Таблица 3

Таблица 4

Примечание. Размер пор мембраны равен 10000 Да, рН фильтрата 5,0

Примечание. Степень концентрирования равна 10, размер пор мембраны 10000 Да

Таблица 5

Таблица 6

Таблица 8

Наименование сырья, материалов и энергоресурсов, единица измерения

СЫРЬЕ И МАТЕРИАЛЫ питательная среда Са(ОН)2, кг хлористый барий углекислый аммоний,

ЭНЕРГОРЕСУРСЫ Пар перегретый, р 0.75МПА t (185 + -5)°C, ГКал

Вода питьевая,хозяйственная, куб.м Сжатый воздух, тн/м Холод:

- захоложенная вода, р (0,27 - 0,3) ГКал

- оборотная вода, куб.м

Электроэнергия, Квт ч/усл.т

Сточные воды, куб.м Теплознергия, ГКал/усл.т

Таблица 9

Удельные нормы расхода Предл я где- Прототип мый способ

Н е и з м е н н ы

20,F 3,0

0.008

ЗОь-Ь

150+-10 40+-10

600 +-270|

b.7I

80 - - 2fiи

...JLLl., L..-

Таблица 10