Способ получения овомукоида Советский патент 1988 года по МПК C07K2/00 C07K16/02 

Изобретение относится к области биохимии и медицинской промышленности, а именно к способу получения ово- мукоида, который является эффектив- ным ингибитором протеолитш:еских ферментов и используется для создания биоспецифических сорбентов для извлечения протеолитических ферментов из различных биологических жидкостей, включая кровь.

Цель изобретения - повьшение выхода и степени чистоты овомукоида, а также расширение спектра ингибируемых ферментов.

Способ состоит в добавлении к белку яиц при перемешивании равного объема смеси 0,5 М водного раствора три- хлоруксусной кислоты и органического растворителя, отделении образующегося осадка фильтрованием при 0-5°С, добавлении к фильтрату органического растворителя, удалении надосадочной жидкости декантированием, диализе осадка против дистиллированной воды и высушивании овомукоида, в качестве органического растворителя используют этанол, а в качестве белка яиц используют белок утиных яиц, причем к белку утиных яиц добавляют смесь 0,5 М вод- ного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном отношении 1;1,8- 2,3, к фильтрйту этанол добавляют при объемном отношении этанола и фильтрата 3-3,5:1 и высзппивают, высушивание овомукоида проводят лиофильно.

Добавление к белку утиных яиц смеси 0,5 М водного раствора трихлорук- -сусной кислоты и этанола в объемном отношении 1:1,8-2,3 приводит к более полному осаждению балластных белков, чем в известном способе. Использовани этанола на последзпощей стадии осаждения овомукоида обеспечивает более полное осаждение и увеличение выхода овомукоида. Обязательным условием полного осаждения овомукоида является наличие в фильтрате вводимой на первой стадии смеси водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола. При этом наиболее оптимальные параметры процесса (по выходу овомукоида и по степени его чистоты) достигаются только при использовании указанных соотношений. Уменьшение количества вод- ного раствора трихлоруксусной кислоты приводит к увеличению содержания балластных белков в овомукоиде (степень чистоты овомукоида при соотношении.

, Q

5

0 5 о

д г

5

5

0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола 1:2,4 составляют 82%), а увеличение этого количества до соотношения 1:1,7 приводит к снижению выхода овомукоида до 0,8 г на 100 мл яичного белка.

Уменьшение количества добавляемого к фильтрату этанола также приводит к снижению выхода овомукоида (до 0,7 г на 100 мп яичного белка при объемном отношении этанола и фильтрата 2,9:1), а увеличение количества этанола приводит к его непродуктивному расходу практически без изменения выхода и степени чистоты овомукоида.

В отличие от куриного, получаемьй по предлагаемому способу овомукоид из белка утиных яиц содержит два ан- титриптических центра и один антих - мотриптический центр и 1 мг этого овомукоида способен ингибировать активность 1,95 мг трипсина (в том числе человека) и 0,97 мг химотрипси- на. Кроме того, этот овомукоид способен ингибировать активность бактериальной, панкреатической и лейкоцитарной эластазы в количестве до 0,9 мг эластазы на 1 мг овомукоида.

Пример 1, Яйца утки разбивают и отделяют белки. К 300 мл белка при 20 С и перемешивании добавляют 300 мл смеси 107,14 мл 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 192,86 мл этанола (объемное отношение 1:1,8).

После добавления всего количества смеси реакционную массу перемешивают 30 мин. Выпавший осадок отфильтгровы- вают при О С и отбрасывают. К фильтрату добавляют 1960 мп этанола (3,5 объема на 1 объем фильтрата) и смесь оставляют на сутки при 0°С для полного вьзделения осадка овомукоида. Затем надосадочнзт) жидкость -удаляют декантированием, осадок переносят в диализньй мешок и диализуют против дистиллированной воды в течение 2 сут. В результате диализа осадок растворяется, образующийся раствор переносят из диализного мешка в колбу и лиофильно сушат.

Степень чистоты овомукоида определяют путем пропускания раствора овомукоида в трис-буфере (рН 8,0), содержаш;ем 0,2 М СаС , через колонку с иммобилизованным на сефарозе трипсином и нахождением количества связанного белка (овомукоида) и белка, прошедшего через колонку (балластные белки). Степень чистоты овому- коида равна 91%, выход 2,68 г, т.е. 0,89 г на 100 мл яичного белка.

П р и м е р 2. Процесс проводят по примеру 1, но используют 300 мп смеси 90,91 мл 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 209,09 мл этанола (объемное отношение 1:2,3), фильтрование проводят при 5°С и к фильтрату добавляют 1650 мп этанола (3 объема на объем фильтрата) .

Степень чистоты овомукоида равна 85%, выход 3,19 г, т.е. 1,06 г на 100 мг яичного белка.

Пример 3. Процесс проводят по примеру , но в качестве исходного сырья используют замороженные при белки утиных яиц. Белки размораживают и на 100 МП белков используют 100 МП смеси 35 мп 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и 65 МП этанола (объемное отношение 1:1,86), фильтрование проводят при 5°С и к фильтрату добавляют 550 мп этанола (3,1 объема на 1 объем фильтрата)-.

Степень чистоты овомукоида равна 87%, выход 0,93 г на 100 мл яичного белка.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить выход овомукоида с 0,65-0,72 до 0,89-1,06 г на 100 мл яичного белка и повысить степень чистоты овомукоида с 80 до 85-91%

Это позволяет более эффективно использовать исходное сырье (утиные яйца) и снизить стоимость как самого овомукоида, так и материалов, синтезированных с его применением (гемо- сорбентов и гемосовместимых полимеров) ,

Формула изобретения

5

Способ получения овомукоида, предусматривающий добавление к белку яиц при перемешивании равного объема смеси 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и органического растворителя, отделение образующегося осадка фильтрованием при 0-5 С, добавление к фильтрату органического растворителя, удаление надосадочной жидкости декантированием, диализ осадка против дистиллированной воды и высушивание овомуко1ада, о тличаю- щ и и с я тем, что, с целью повышения выхода и степени чистоты овомукоида, а также расширения спектра ин- гибируемых ферментов, в. качестве органического растворителя используют этанол, в качестве белка яиц используют белок утиных яиц, к которому добавляют смесь 0,5 М водного раствора трихлоруксусной кислоты и этанола в объемном отношении 1:1,8-2,3, а к фильтрату этанол добавляют при объем- . ном отношении этанол:фильтрат 3-3,5:1 и высушивание овом коида проводят лиофильно.

0

5

0

5

Изобретение относится к биохимии и медицинской промышленности и может быть использовано в препаративной и аналитической биохимии, химии медико-биологических полимеров и в медицине для извлечения протео- литических ферментов из биологических жидкостей, включая и кровь. Изобретение позволяет повысить выход овомукоида и степень его очистки до 85-91%, а также расширить спектр ин- гибирующих ферментов, что достигается использованием белка утиных яиц, смеси 0,5 М водного раствора трихлор- уксусной кислоты и этанола в объемном соотношении 1:1,8-2,3 и добавлением к фильтрату этанола при объемном соотношении этанола и фильтрата 3- 3,5:1. о (О Ф (Л с: