СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ОВОМУКОИДА Российский патент 1997 года по МПК C07K1/14 C07K1/30 

Изобретение относится к области биотехнологии и касается способа получения овомукоида (ОМ) из цельного белка куриных яиц (ЦБЯ).

Изобретение наиболее эффективно может быть использовано в технологических процессах выделения индивидуальных протеинов из белка куриных яиц.

Известен способы получения овомукоида путем обработки ЦБЯ трихлоруксусной кислотой или ее солями (1,2). При этом преимущественно осаждаются сопутствующие протеины, а овомукоид остается в супернатанте. Последующее осаждение ОМ из супернатанта проводят этиловым спиртом или ацетоном. Недостатками этих способов являются применение высокотоксичного вещества - трихлоруксусной кислоты и большой расход органических растворителей.

Известен способ получения ОМ, выбранный нами за прототип (3), предусматривающий осаждение основной массы сопутствующих белков ЦБЯ, за исключением ОМ, смесью 0,5 М трихлоруксусной кислоты и ацетона при соотношении 1:1,5 при рН 3,5. Дальнейшую очистку ОМ проводят двухкратным осаждением ацетоном при объемном соотношении раствор ОМ ацетон равном 1:2,5.

Недостатком способа-прототипа также является использование токсичной трихлорукссной кислоты.

Другим недостатком известного способа является использование больших количеств ацетона.

Задачей настоящего изобретения является разработка экологически более чистого способа получения овомукоида за счет исключения трихлоруксусной кислоты и снижения расхода органических растворителей.

Решение поставленной задачи достигается тем, что вместо трихлоруксусной кислоты осаждение сопутствующих протеинов проводят полиэтиленгликолем (ПЭГ), концентрирование овомукоида в супернатанте также проводят полиэтиленгликолем, а очистку ОМ осуществляют ацетоном.

Сущность предлагаемого изобретения заключается в том, что в предварительно подготовленный ЦБЯ вводят при перемешивании ПЭГ с молекулярной массой (ММ) от 1,0 до 20,0 кД при концентрации полимера (С пэг, 1 ст.) 8,0-16,0 вес. Указанная концентрация ПЭГ соответствует оптимальным значениям при которых 50,0-85,0% сопутствующих протеинов переходит в осадок, в то время как основная часть ОМ остается в супернатанте. Использование ПЭГ с ММ мене 1,0 кД не эффективно из-за большого расхода полимера, а использование ПЭГ с ММ более 20,0 кД приводит к большой вязкости системы. После полного растворения ПЭГ (1-2 часа) систему ЦБЯ ПЭГ выдерживают при комнатной температуре несколько часов. Образовавшийся осадок протеинов отделяют центрифугированием и отбрасывают. К супернатанту прибавляют при перемешивании ПЭГ до достижения его концентрации в системе 18,0-28,0% вес. (С пэг, 2 ст.). При концентрации ПЭГ ниже 18,0 вес. овомукоид осаждается не полностью, а увеличение концентрации ПЭГ выше 28,0 вес. не приводит к увеличению количества осаждаемого ОМ. После полного растворения ПЭГ систему выдерживают при комнатной температуре несколько часов, затем декантируют верхнюю фазу, оставляя вязкую жидкую фазу, содержащую овомукоид.

Фазу, содержащую ОМ разбавляют дистиллированной водой, доводят уксусной кислотой до рН 3,8-4,8, осветляют полученный раствор центрифугированием (Т-24, 1500 g, 10 мин.) и смешивают с ацетоном при соотношении 1:2,5. За интервалами этих значений рН выход целевого продукта уменьшается. Образовавшуюся суспензию выдерживают в течение мочи на холоду при 4-6 град.С. затем отделяют осадок ОМ центрифугированием. Осадок дважды экстрагируют дистиллированной водой, супернатанты объединяют и высушивают лиофильно. В результате получают препарат овомукоида с чистотой 95,0-96,0% Выход 50,0 80,0%
Ниже приводится конкретный пример осуществления предлагаемого способа.

Пример 1.

Проводят предварительную подготовку ЦБЯ, фильтруя гомогенизат яичного белка через грубый тканевый фильтр. К 250 мл подготовленного белка при перемешивании добавляют сухой ПЭГ с ММ 4,5 кД в количестве 44,1 г, что составляет 15,0% вес. (Спэг, 1 ст). Смесь перемешивают 0,5 час до полного растворения ПЭГ, затем выдерживают 12 часов при комнатной температуре. Образовавшийся осадок протеинов отделяют центрифугированием (Т-24, 1500 g, 10 мин) и отбрасывают. К супернатанту вновь добавляют при перемешивании ПЭГ в количестве 25,8 г, что составляет 23, вес. (Спэг, 2 ст.). После полного растворения ПЭГ смесь оставляют на 12 часов при комнатной температуре. Верхнюю фазу отделяют и отбрасывают, а нижнюю, которая представляет собой жидкую вязкую массу разбавляют вдвое дистиллированной водой. К раствору добавляют уксусную кислоту до рН 4,5, центрифугируют и добавляют 115 мл ацетона при объемном соотношении 1:2,5. Смесь оставляют на ночь на холоду, после этого осадок ОМ отделяют центрифугированием (Т-24, 15000 g, 10 мин.) и дважды экстрагируют дистиллированной водой, экстракты соединяют и лиофильно высушивают.

Выход препарата ОМ составляет 2,1 г (77%). Чистота по данным хроматографического анализа 96,0%
Другие примеры осуществления способа представлены в табл. 1.

Использование предлагаемого способа позволяет исключить применение высокотоксичного реагента трихлоруксусной кислоты.

Вследствие этого предлагаемый способ становится экологически более чистым.

Кроме того, способ позволяет более чем в 10 раз сократить расход ацетона по сравнению со способом-прототипом за счет концентрирования овомукоида полиэтиленгликолем.

Литература
1. Lineweaver H. Murray C.W. J.Bil.Chem. 171, 565 (1947).

2. E.Frederica, H.F.deutsch, J.Biol.Chem. 181, N 2, p. 499-510 (1949).

3. В. Х. лапук, Вопросы медицинской химии, 1966 г. т. 12, вып. 6, стр. 636-638.

Использование: биотехнология. Сущность изобретения: способ получения овомукоида из цельного белка куриных яиц, включающий осаждение сопутствующих белков полиэтиленгликолем, концентрирование овомукоида также полиэтиленгликолем и очистку овомукоида ацетоном при рН 3,8-4,8. Использование предлагаемого способа позволяет исключить применение высокотоксичного реагента - трихлоруксусной кислоты. Вследствие этого предлагаемый способ становится экологически более чистым. Кроме того, способ позволяет более чем в 10 раз сократить расход ацетона по сравнению со способом-прототипом за счет концентрирования овомукоида полиэтиленгликолем. 1 табл.

1 Способ получения овомукоида из цельного белка куриных яиц путем осаждения сопутствующих протеинов и очистки овомукоида переосаждением ацетоном, отличающийся тем, что осаждение протеинов проводят полиэтиленгликолем с мол.м. 1 20 кД при концентрации полиэтиленгликоля в смеси 8 16 мас. затем проводят концентрирование овомукоида полиэтиленгликолем при его концентрации в смеси 18 28 мас. очистку овомукоида проводят переосаждением ацетоном при pН 3,8 4,8.