Способ определения микроколичеств белка в растворах, содержащих детергенты Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 G01N15/06 

«i (

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может найти применение в любых исследованиях, требующих определения микроколичеств белка. .

Цель изобретения - повышение точности анализа и сокращение времени определения белка в растворах, содержащих детергент.

Изобретение заключается в том, что проводят кислотную денатурацию белка, нанесение его на фильтр, окрашивание специфическим красителем, элюцию окрашенного комплекса с последующим колориметрированием, согласно предлагаемому способу образующийся при кислотной денатурации белка осадок детергентов растворяют этанолом в концентрации 25-30%, после чего белок собирают на фильтре.

Подобранная концентрация этанола (25-30%) растворяет осадки детергентов и не влияет на точность определения количества белка. Концентрация этанола менее 25% не растворяет кис- лотонерастворимые осадки амфифильных соединений, концентрация этанола больше 30% нарушает структуру фильтра, что приводит к искажению резуль- тата. Так как белок собирают на фильтре- путем фильтрации, а не за счет поглотительной сцособности фильтра, то объем пробы, содержащей белок, не ограничен. Минимальное количество определяемого белка 0,5 мкг в любом объеме пробы.

На фиг.1 представлен график зависимости влияния различных концентраций этанола на точность определения белка; на фиг.2 - результаты построения калибровочных кривых.

Точность (фиг.1) представляют как достоверное определение количеств белка в образце относительно стандар та (в качестве стандартного раствора используют раствор бычьего сывороточного альбумина) независимо от присутствующих агентов (различные концентрации и типы амфифильных соединений, этанол). Количество белка в пробе (стандартный раствор бычьего сывороточного альбумина) составляет 10 мкг Из результатов, представленньЕх на графике, следует, что этанол в концентрации 25-30% не влияет на точ- ность определения количества белка в пробе относительно стандарта. При увеличении концентрации этанола выше

0

5 о

д

.с

5

0

30% определяемое количество белка в пробе занижается.

Результаты построения калибровочных кривых (фиг.2) представляют зависимость поглощения окрашенного комплекса при Л 630 нм от количества белка в пробе для стандартного раствора бычьего сывороточного альбумина в присутствии различных детергентов (1%-ный тритон Х-100, 1%-ный саркози- лат натрия, 1%-ньй цетавлон) и 25%- ного этанола. Из представленных результатов следует, что, используя предлагаемый способ, можно достоверно определять микроколичества белка в присутствии детергентов относительно стандартного раствора белка.

Пример 1. Определение концентрации бычьего сывороточного альбумина в стандартном растворе, содержащем 1%-ный тритон Х-100.

Берут 10 мкл раствора белка концентрации 1 мг в 1 мл и вносят в 2 мл 1%-ного раствора тритона Х-100. Затем добавляют 0,5 мл 50%-ного ТХУ. Для удаления образующегося осадка через 2 мин в пробу вносят 0.,8 мл абсолютного этанола (конечная концентрация этанола 25%). Осадок амфильно- го Ьоединения исчезает и раствор фильтруют через мембранный фильтр SYNPOR № 6, предварительно промытый раствором, содержащим 5%-ный ТХУ и 25%-ный этанол. После нанесения образца фильтр промьшают дважды 2 мл раствора 5%-ного ТХУ + 25%-ный этанол. Далее фильтр нанизывают на нержавеющую проволочку и погружают для окрашивания в раствор амидочерного 10 Б (О,1%-ный амидочерный 10 Б в смеси метанолгледяная уксусная кислота :Н 50 45:10:45). Через 3 мин фильтр ополаскивают дистиллированной (30 с), трижды по 1 мин в растворе метанол:ледяная уксусная кисло- 90:2:8 и в течение 2 мин в дистиллированной . Фильтр подсушивают фильтровальной бумагой, помещают в пробирки и заливают 2 мл элюирующе- го раствора (25 мМ NaOH, 0,05 мМ ЭДТА в 50%-ном этаноле). Через 10 мин окрашенный элюирующий раствор коло- риметрировали при длине волны i 630 нм.

Аналогичные процедуры проводят с контрольным фильтром, на который наносят контрольную пробу, не содержащую белок. Окрашивание и промывку

контрольного фильтра проводят одновременно с опытным фильтром, содержащим белок. Опытный и контрольный фильтры нанизывают на одну проволочку и разделят друг от друга стеклянной бусинкой,

В результате проведенных исследований было показано, что этанол в

концентрации 25% растворяет осадок амфифильного соединения, образующийся при взаимодействии тритона Х-100 (который содержится в образцах раствора белка) с ТХУ и, как видно из табл. 1, не влияет на точность определения количеств белка в пробе.

Таблица 1

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине и может найти применение в любых исследованиях, требующих определения микроколичеств белка. Целью изобретения является повышение точности и сокращение времени проведения анализа. Для этого после денатурации белка кислотой образующийся осадок детергентов растворяют 25-30%-ным этанолом, бе- лок собирают на фильтрах, окрашивают амидочерным 10Б, элюируют окрашенный комплекс и определяют оптическую плотность раствора при 630 нм. 2 ил., 3 табл. S ; 0

тритон Х-100 и 25%-ный этанол) и опытных (присутствует тритон Х-100 и 25%-ньш этанол или только 25%-ный этанол) достоверно определяется идентичное количество белка.

Таким образом, используя 25%-ньм этанол, можно достоверно (точно) определять микроколичества белка в присутствии тритона Х-100. Время проведения процедуры определения белка составляет 25 мин.

П р и м е р 2. Определение концентрации белка в суспензии клеток.

100 мкл лизата суспензии клеток асцита Эрлиха, получаемого путем растворения клеток (1,06-10 клеток в 2 мл раствора, содержащего 8 М мо- чевину, детергент (1%-ный саркозилат натрия в 10 мМ фосфатном буфере), .вносят в 2,4 МП 10%-ный ТХУ.

Далее процедуры определения количеств белка ведут как в примере 1, только используемая концентрация этанола 27%.

В результате проведенных исследований показано, что этанол в концентрации 27% растворяет осадок амфифиль- ных соединений, образующийся при обработке пробы ,белка ТХУ, и, следовательно, появляется возможность определить концентрацию белка в лизате суспензии клеток. В качестве стандартного раствора белка использую бычий

0

5

0

5

0

5

сывороточный альбумин, растворенный в растворе, содержащем 8 М мочевину, 1%-ный саркозилат натрия в 10 мМ фосфатном буфере.

100 мкл лизата суспензии клеток содержат 24 мкг белка. Таким образом, согласно предлагаемому способу, проведено определение концентрации белка в лизате суспензии клеток. Время проведения анализа 25 мин.

П р и м е р 3. Определение концен- трации белка в суспензии клеток.

Условия вьшолнения процедуры определения белка как в примерах 1 и 2, только в качестве детергентов для получения лизата клеток используют 1%- ный цетавлон в присутствии 8 М мочевины и 10 мМ фосфатного буфера и для удаления осадков амфифильного соединения применяют этанол в концентрации 30%.

В результате проведенных исследований показано, что для устранения кислотонерастворимого осадка амфифильного соединения, образующегося после обработки пробы белка ТХУ, применима 30%-ная концентрация этанола. Определено, что 100 мкл лизата суспензии клеток содержат 24 мкг белка. . Таким образом, появляется возможность определить микроколичество белка в лизате клеток асцита Эрлиха. Время проведения анализа 25 мин.

Данные, доказывающие положительный эффект предлагаемого способа, сведены в табл. 2 и 3, В табл. 2 представлены результаты, характеризующие влияние детергентов на точность определения концентрации белка.

Таблица2

Известный Тритон Х-100 Додецилсульфат натрия

т(ДОХ) 1

зультатов на 50%

Занижение результатов на 20%

Занижение результатовна 20%

Предлагаемый способ Тритон Х-100

Цетавлон

Саркозилат

Мочевина

0,4-1 Не влияет 0,1-1 ,1-1 М

Как видно из табл. 2, в предлагаемом способе детергенты не влияют на точность определения концентрации белка, т.е. сравнение контрольных проб (не содержат амфифильных соединений) с пробами, содержащими амфи- фильные соединения, дает идентичные результаты.

В табл. 3 представлено сравнение времени проведения эксперимента по определению концентрации белка согласно известному и предлагаемому способам для 10 образцов белка.

Операции способа (на 10 проб белка)

ТаблицаЗ Время проведения эксперимента, мин, по способу

известный

предлагаемый

Нанесение проб белка на фильтры

Фиксация ТХУ Окрашивание кра10-30 (4 С) 2

(t комн.

сителем

Отмывка не связавшегося красителя

общая

индивидуальная Вырезание окрашенного пятная Элюция окрашенного комплекса Центрифугирование (уравновешивание, центрифугирование и т.д.)

Подкисление супер- натанта Итого:

20

15 10

5,2

10

15

5 1,5-2

25

5

0

5

Примечание. (-)- операция

отсутствует .

Как следует из табл. 3, в предлагаемом способе процедура определения белка сокращается в 3-4 раза по сравнению с известным. Формула изобретения.

Способ определения микроколичеств белка в растворах, содержащих детергенты, включающий кислотйую денатурацию белка, нанесение его на фильтр, окрашивание специфическим красителем, элюцию окрашенного комплекса и последующее крлориметрирование, чающийся тем повышения точности

о т л и - , что, с целью и сокращения времени проведения анализа, образующий50

ся в кислой среде осадок детергентов

растворяют 25...30%.

этанолом в концентрации

t

I 0.16

I

I

ч;

2030

ЗтаноА Ve

50

Фиг.1

{контроль 25 f этанол

/% цешаблон / % саркозимт / % тритон K-WQ