НАБОР lux-БИОСЕНСОРОВ ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ДЕТЕРГЕНТОВ ГИДРОФОБНОЙ ПРИРОДЫ В СРЕДЕ Российский патент 2009 года по МПК C12N1/21 C12N15/70 C12Q1/02 C12R1/19 

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии и может быть использовано при оценке степени загрязнения окружающей среды детергентами гидрофобной природы (под термином гидрофобные в данном контексте понимаются детергенты, слабо проникающие через мембрану клетки). Методом рекомбинантных ДНК получены клетки Escherichia coli, содержащие плазмиды с бактериальными luxCDABE-генами под контролем индуцибельных стрессовых промоторов PrpoE, PgrpE и неиндуцибельного Plac промотора. На их основе разработан набор проб бактериальных клеток Е.coli для определения детергентов гидрофобной природы в окружающей среде. Применение изобретения позволяет быстро в стационарных или полевых условиях определять содержание детергентов гидрофобной природы в окружающей среде. Изобретение относится к оценке степени загрязнения окружающей среды детергентами гидрофобной природы, а также может быть использовано в исследованиях биологических объектов.

Известен способ определения детергентов гидрофобной природы в окружающей среде химическими средствами [1-3]. Существо этого способа заключается в проведении экстракционно-фотометрического определения анионных ПАВ (алкилсульфатов, алкилсульфонатов, алкилбензолсульфонатов) или высокоразрешающего хроматографического (газовая хроматография) разделения химических соединений с масс-спектрометрическим детектированием [1] и идентификацией детергентов и их продуктов распада с помощью методов ЯМР и инфракрасной спектроскопии [2]. Недостатком химических методов является необходимость использования дорогостоящей аппаратуры, а также сложность проведения анализа в связи с высоким разнообразием детергентов гидрофобной природы [3].

В настоящее время широкое распространение для определения загрязнения окружающей среды токсичными веществами получили методы биотестирования с использованием lux-биосенсоров. Известны методы, основанные на тушении биолюминесценции токсикантами, в которых используется механизм ингибирующего действия ядовитых веществ на метаболизм клетки, в основном на дыхательную цепь, что опосредованно влияет на люциферазную реакцию, вызывая ослабление интенсивности биолюминесценции клеток. В этой серии методик, используемых в качестве экспресс-контроля токсичности природных сред, наибольшее распространение в странах Европы и в США получил т.н. "Микротокс" (Microtox 5TM), в котором в качестве биосенсора используются лиофилизированные морские бактерии Photobacterium phosphoreum. Недостатком метода является неспецифичность реакции и невысокая чувствительность. Для идентификации химического соединения, вызвавшего уменьшение интенсивности свечения клеток, требуется дополнительный анализ.

Известно также обнаружение токсикантов с использованием lux-биосенсоров на основе бактерий E.coli, содержащих плазмиды с lux-генами под контролем индуцибельных стрессовых промоторов [4]. Эти lux-биосенсоры, как указано в приведенном патенте США [5], были использованы для определения нитратов, фенолов, бензина и других токсикантов, но не использовались для обнаружения в среде детергентов гидрофобной природы, не проникающих в клетку. Промотор PrpoE для обнаружения токсикантов ранее не использовался.

Техническим результатом предложенного изобретения является возможность осуществления быстрого, не требующего дорогой и сложной аппаратуры, как в стационарных, так и в полевых условиях, контроля за содержанием детергентов гидрофобной природы в окружающей среде.

Для достижения этого результата предложено использовать набор lux-биосенсоров на основе бактерий E.coli, содержащих гибридные плазмиды с lux-генами под контролем индуцибельных стрессовых промоторов PrpoE, PgrpE и неиндуцибельного Plac промотора. В предложенном изобретении для определения детергентов гидрофобной природы сконструирована группа биосенсоров, обладающих свойством индукции (усиления) сигнала (биолюминесценции) клеток при воздействии токсикантов, денатурирующих клеточные белки, а также высокой чувствительностью и специфичностью, которая определяется особенностью взаимодействия белка-рецептора (репрессора или активатора) с химическим соединением. Детергенты гидрофобной природы способны денатурировать белки, но в отличие от спиртов (которые также способствуют денатурации белков) не проникают внутрь клетки. Использование двух сенсоров PrpoE::lux и PgrpE::lux, один из которых чувствителен к денатурации белков внутри клетки (PgrpE::lux), а другой к денатурации белков в клеточной мембране и периплазматическом пространстве (PrpoE::lux), позволяет различать эти соединения по их воздействию на клетку. Биосенсор Plac::lux, сконструированный на основе неиндуцибельного Plac промотора, позволяет по падению люминесценции отследить наличие любых токсикантов (померить интегральную токсичность как в Microtox методе) при сравнительно высоких концентрациях, влияющих на жизнеспособность бактериальных клеток.

Существо изобретения определяется возможностью с помощью биосенсоров получать следующие зависимости:

1. Зависимость активации биолюминесценции биосенсора PrpoE::lux от времени действия детергентов гидрофобной природы (додецил сульфата натрия (ДСН)) или этанола (при фиксированной концентрации).

2. Зависимость величины эффекта от концентрации ДСН в образце (при оптимальном времени выдерживания препарата) для биосенсора PrpoE::lux.

3. Зависимость биолюминесценции биосенсора PgrpE::lux от времени действия этанола и ДСН.

4. Концентрационная зависимость действия ДСН и этанола на биосенсор Plac::lux.

В процессе действия токсикантов, денатурирующих белки, на клетку происходит индукция биолюминесценции у биосенсоров PrpoE::lux и PgrpE::lux. При выдерживании проб с фиксированной концентрацией токсикантов, денатурирующих белки, наблюдается со временем (в течение часа) значительное усиление (примерно в 10-20 раз для этанола и в 5-10 раз для ДСН) интенсивности биолюминесценции клеток-биосенсоров PrpoE::lux. Этот эффект позволяет снять кривую увеличения биолюминесценции для биосенсора с промотором PrpoE::lux в зависимости от количества ДСН в пробе. В кривой можно выделить три характерных области. При концентрации ДСН в пробе более 3% наблюдается значительный токсический эффект детергента на клетку, что проявляется в гашении биолюминесценции. При концентрациях ДСН примерно от 1 до 0,1% наблюдается значительное усиление биолюминесценции, превышающее исходное значение Io более чем в 3 раза. И, наконец, при количестве ДСН в пробе менее 0,01% влияние детергента снижается практически до фона, т.е. пороговая концентрация ДСН, фиксируемая lux-биосенсором с промотором PrpoE, равна 0,05%. Зависимость активации биосенсора PgrpE::lux от времени действия этанола и ДСН имеет свои характерные особенности. PgrpE::lux биосенсор в присутствии спирта активируется в 20 раз (это связано с денатурирующим действием этанола) и, напротив, добавление ДСН (0,5%) не влияет на активацию промотора grpE (поскольку ДСН не проникает внутрь клетки), что позволяет в данной системе дифференцировать агенты, денатурирующие белки, проникающие внутрь клетки, от детергентов гидрофобной природы, не проникающих внутрь бактериальных клеток. С помощью биосенсора Plac::lux определяется токсическое действие ДСН и спирта на клетки (при больших концентрациях проявляется угнетение люминесценции). ДСН угнетает люминесценцию при концентрациях свыше 2-3% (как и для PrpoE::lux биосенсора), а спирт при 4-8%. Этот результат соответствует данным по летальному действию ДСН на бактерии E.coli: гибель бактерий фиксировалась при 2% ДСН и выше в пробе.

У бактерий можно выделить регуляторные системы, специфически реагирующие на различные токсиканты, действующие на: 1) клеточные мембраны; 2) белки; 3) хромосому (ДНК), а также 4) индуцирующие в клетке окислительный стресс. В настоящем изобретении использовались регуляторные системы, чувствительные к модификации, денатурации клеточных белков, которые управляют различными генами "теплового шока". В клетках E.coli существует две системы. В качестве биосенсора на токсиканты, действующие на клеточные белки, предложено использовать промоторы PrpoE и PgrpE. Эти промоторы в бактериальном геноме расположены перед генами "теплового шока" и открывается лишь при появлении в клетке модифицированных, денатурированных белков. Промотор PgrpE открывается РНК полимеразой с sigma32 субъединицей и чувствителен к денатурации белков внутри клетки, а промотор PrpoE открывается РНК полимеразой с субъединицей sigmaE (причем ген rpoE кодирует эту субъединицу) в ответ на денатурацию белков клеточной мембраны и периплазматического пространства [6]. Неиндуцируемый в данных условиях Plac промотор используется для оценки общей токсичности.

В данном изобретении сконструированы основанные на этих индуцируемых промоторах специфические lux-биосенсоры. Все используемые промоторы с соответствующими регуляторными участками были получены из генома бактерий E.coli' К12 MG1655 [7] с помощью метода ПЦР с использованием специальных синтезированных праймеров. В качестве вектора использовали беспромоторный вектор с репликоном Со1Е1 и геном bla, определяющим резистентность к ампициллину (селективный маркер)[4]. Встраивание промоторной области в плазмиду проводили по сайтам EcoRI-BamHI. В качестве lux-кассеты был выбран lux-оперон Photorhabdus luminescens, состоящий из пяти генов, luxCDABE. Данная кассета имеет два преимущества: во-первых, люцифераза Ph. luminescens (гены luxAB) отличается сравнительно высокой термостабильностью, а во-вторых, к суспензии клеток не надо добавлять субстрат люциферазной реакции - алифатический альдегид, так как он синтезируется в клетке при помощи белков, кодируемых генами luxCDE [8].

Методика измерения влияния токсиканта на биолюминесценцию биосенсора была одинаковой для всех lux-биосенсоров.

Определение детергентов гидрофобной природы в среде с помощью lux-биосенсоров требует проведения следующих операций.

1. Приготовление проб, содержащих соответствующие биосенсоры:

- выращивание клеток Е.coli, являющихся биосенсорами, до экспоненциальной фазы (OD=0,2-0,4);

- отбор проб по 200 мкл в виалы (6-8 виал для каждого биосенсора).

2. Добавление к пробам детергентов гидрофобной природы или жидкой среды с детергентами гидрофобной природы в различных концентрациях:

- приготовление для каждого биосенсора положительного и отрицательного контролей. В качестве положительного контроля используют ДСН (разведенный в воде) в концентрации 0,5% (отрицательный контроль - дистиллированная вода);

- добавление по 20 мкл исследуемой среды к каждой пробе каждого биосенсора.

(Все пробы следует приготовить в двух или трех экземплярах и затем использовать средние значения полученных экспериментальных величин).

3. Измерение интенсивностей биолюминесценции проб в течение 1-2 часов.

4. Обработка полученных результатов. Полученные графики на контрольных образцах сравнивают с исследуемым образцом.

Культуру клеток, содержащих гибридную плазмиду с соответствующим промотором и lux-кассетой, растят при 28°С или 37°С на качалке до ранней или средней экспоненциальной фазы (00=0,2-0,4). Аликвоты этой культуры (по 200 мкл) переносят в стерильные виалы и добавляют в них по 10 мкл тестируемого вещества требуемой концентрации. В контрольную пробирку добавляли 10 мкл дистиллированной воды. Затем пробы инкубировали без перемешивания при 30°С и через каждые 15 мин измеряли интенсивность биолюминесценции при комнатной температуре. Усиление сигнала фиксировалось уже через 15-20 мин - время, необходимое для синтеза люциферазы. Максимальный ответ биосенсора, как правило, наблюдался через 40-60 мин и при оптимальной концентрации токсиканта превышал начальный сигнал в 5-20 раз. Фактор индукции люминесценции R вычисляется по следующей формуле: R=(I_t-I₀)_опыт/(I_t-I₀)_{контроль}, где I₀ - значение интенсивности биолюминесценции клеток в микровольтах перед добавлением к ним токсиканта, R - фактор усиления экспрессии генов-репортеров с данного промотора, t - оптимальное время индукции, варьируется в зависимости от природы биосенсора.

В результате наших исследований показано, что в присутствии детергентов гидрофобной природы происходит активация PrpoE::lux биосенсора, но не биосенсора PgrpE::lux. В присутствии токсикантов, денатурирующих белки, способных проникать в клетку, активируются оба биосенсора. Контроль общей токсичности исследуемого препарата осуществляется с помощью Plac::lux биосенсора. Нормировочная кривая, отражающая концентрационную зависимость активации (усиления биолюминесценции) биосенсора, позволяет оценить концентрацию токсиканта.

В табл.1 приведены данные о минимальных (пороговых) концентрациях стандартных, специфических для данного промотора веществ, индуцирующих заметный (не менее 50%) эффект усиления биолюминесценции, в конструированных lux-биосенсорах (этанол индуцирует повреждения в белках, проникает в клетки, ДСН и Тритон Х-100 - детергенты, не проникающие в клетку). Для биосенсора Plac::lux даны концентрации, вызывающие заметное (не менее 50%) падение люминесценции.

Таблица 1 Биосенсор Стандартное вещество Пороговая концентрация, % Фактор индукции биолюминесценции R PrpoE::lux Этанол 0,5 1,5 PrpoE::lux ДСН 0,05 1,6 PrpoE::lux тритон х-100 0,2 1,5 PgrpE::lux Этанол 0,5 1,7 Plac::lux Этанол 5 0,3 Plac::lux ДСН 2 0,5 Plac::lux тритон х-100 3 0,4

Влияние детергентов гидрофобной природы на биосенсор PgrpE::lux практически отсутствует, поэтому данные о воздействии ДСН и Тритон Х-100 на этот биосенсор не приводятся. Детергенты гидрофобной природы не проникают внутрь клетки до тех пор, пока не разрушится клеточная мембрана (а после разрушения мембраны не работает репортер - люцифераза).

Использование заявленного набора биосенсоров позволяет создать чувствительный, дешевый и быстрый тест-метод на основе измерения интенсивности биолюминесценции.

Источники информации

1. Чернова Р.К., Ястребова Н.И., Панкратов А.Н. Новый реагент для экстракционно-фотометрического определения анионных поверхностно-активных веществ. Заводская лаборатория. 1994. Т.60, №8. С.4-6.

2. Лопырев В.А., Долгушин Г.В., Ласкин Б.М. (2001) Журнал Рос. хим. об-ва им. Д.И.Менделеева, т.XLV, №5-6, стр.149-156.

3. Овчинников Ю.А. Биоорганическая химия. М.: Просвещение, 1987. С.513-636.

4. Cheng Vollmer A, Van Dyk TK. Stress responsive bacteria: biosensors as environmental monitors. Adv Microb Physiol. 2004, 49:131-74.

5. Патент США №5683868, C12Q 1/68 - прототип.

6. Rouviere PE, De Las Penas A, Mecsas J, Lu CZ, Rudd KE, Gross CA. rpoE, the gene encoding the second heat-shock sigma factor, sigma E, in Escherichia coli. EMBO J. 1995 Mar 1;14(5):1032-42.

7. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. Escherichia coli K12 MG1655, complete genome. gi|48994873|gb|U00096.2|[48994873].

8. Завильгельский Г.Б., Зарубина А.П., Манухов И.В. (2002) Молекулярная биология, т.36, стр.792-804.

Изобретение относится к биотехнологии и генной инженерии. Предложен набор lux-биосенсоров, состоящий из полученных методом рекомбинантных ДНК клеток Escherichia coli, содержащих плазмиды с бактериальными luxCDABE-генами под контролем индуцибельных стрессовых промоторов PrpoE и PgrpE и неиндуцибельного Plac промотора. Изобретение может быть использовано при оценке степени загрязнения окружающей среды детергентами гидрофобной природы. 1 табл.

Набор lux-биосенсоров для определения детергентов гидрофобной природы в среде, состоящий из пробы клеток Escherichia coli, трансформированных плазмидой, содержащей бактериальные luxCDABE-гены под контролем промотора PrpoE, пробы клеток Е.coli, трансформированных плазмидой, содержащей бактериальные luxCDABE-гены под контролем промотора PgrpE, пробы клеток Е.coli, трансформированных плазмидой, содержащей бактериальные luxCDABE-гены под контролем промотора Plac.