(21) 3995744/28-14
(-22) 23.12.85
(46) 30.09.88. Бкш. 36
(71)Киевский научно-исследовательский институт эндокринологии и обмена веществ, и Всесоюзный научно-исследовательский институт гигиены и токсикологии пестицидов, полимеров и пластических масс
(72)С.В.Кандул, М.И.Яцык и В.Я.Кононенко
(53)616.07 (088.8)
(56) Vernikos - Danellis J.et.all, Changes in adrenal corticosterone concentration in rats: method of bioassay for ACTH. - Endocrinology, 1966, 70, w 3, p. 624-630.
(54)СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ, НАПРАВЛЕННО ВЛИЯЮЩИХ НА ФУНКЦИЮ КОРЫ НАДПОЧЕЧНЫХ ЖЕЛЕЗ
(57) Изобретение относится к эндокринологии. Цель изобретения - ускорение и упрощение способа, Белым крысам вводят изучаемое соединение. После декапитации у крыс извлекают надпочечники и замораживают. Затем образцы помещают в кварцевый сосуд Дьюара и регистрируют электронно-парамагнитный резонанс (ЭПР). Интенсивность сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках крыс, которым вводят изучаемое соединение, сопоставляют с величиной этого сигнала в надпочечниках интактных животных. Отмечено, что фенобарбитал вызывает значительное увеличение интенсивности сигналов g ЭПР феррицитохрома Р-450. Это свидетельствует о существенном влиянии этого препарата на функцию надпочечников. 2 ил., 3 табл.;
(Л С
Изобретение относится к медицине, а г-шеныо к эндокринологии, и может быть использовано дпя первичного скрининга новых биологически активных соединенийэ обладающих адренокортико- тропной активностьюо
Цель изобретения - ускорение и угфощение способа,
Способ осуществляется следующим образомо
Материалом для исследования служат белые крысы-самцы массой 100 . 200 г, которьзм внутримышечно вводят изучаемое соединение. Через определенные промежутки времени, например 20,, 40J бОд 120 и т„д, мин, крыс де- капитируют и тот час извлекают надпочечники,, очищают на холоде от жировой клетчатки и заг-юраживают в жидком азоте„ Замороженные образцы по мещают в кварцевый сосуд-Дьюара и регистрируют на радиоспектрометре ЭПР Запись спектров проводят по общепри нятой методике при 77К (), рабочей частоте спектрометра 9,5 Гц, напря5Х8нности магнитного поля 265- 365 мТЛ; развертке поля 100 мТл, скорости разверТ1Ш 25 мТл, постоянной времени 0,5 с амплитуде модуляции . Oj8 мТл и мощности падающей СВЧ 5 мВт В качестве внутреннего стандарта слу- хсит кристалл рубина, помещенный в рабочем объеме резонатора. Спектр ЭПР феррицитохрома Р-450 характеризуется g--§aKTOpaMH 2,42 и 2,25 (фиг,1) Измене ше ве п-вшны сигнала ЭЦР ферри- цитохрома рассчитывают по наиболее интенсивной компоненте с g 2j253 величина которой пропорциональна содержанию феррицитохрома Содержание этой формы цитохрЬ ма в надпочечниках выражают в относительных единицах.
Интенсивность сигнала ЭПР феррицитохрома в надпочечниках под-опытных крыс, которым вводят изучаемое, соединение, сопоставляют с вели чиной этого сигнала в надпочечниках контрольных животньпс, получающих только растворитель для данного веще- ства„ Наличие рагуляторной функции у изучаемого химического, вещества основывается на выявлении изменения интенсивности сигнала ЭПР феррицито™ хрома в надпочечниках опытных крыс по отношению к величине аналогичного показателя в .надпочечниках контрольных животных о
s
5
0
S
5
Используют известные фармакопейные препараты, активизирующие функцию коры надпочечных железj а именно кортикотропин (АКТГ,. , ) (СССР) и синактен-депо (АКТГ. ) (Швейцария), а также ингибитор, секреции АКТГ из гипофиза - дексаметазон (Югославия)„
Пример , Исследовали химические вещества, неизвестные по своему Действию на функцию коры надпочечных желез; вилозен (препарат из ви- лочковой железы телят), децис и пер- метрин (вещества, обладающие свойствами инсектицидов), фенобарбитал (препарат, обладающий снотворным и противосудорожным действием).
Все перечисленные выше вещества вводили крысам-самцам массой 100- 200 г .натощак однократно внутрш Ы шечно. Вещества растворяли в физиологическом растворе. Величину дозы рассчитьюали исходя из массы животного. Исследования проводили -20- 120 мин. Крысам контрольньк групп вводили эквивалентные объемы физиологического раствора.
Животных декапитировали. Обрабо.т-. ку надпочечников проводили по опи-г санной выше методике. Результаты исследований представлены на фиг,.2, где 1-кортикотропин, 2-синактен, 3-вилозен, 4-децис, 5-перметрин, 6-фенобарбитал, 7-дексаметазон.
Изменение интенсивности сигнала ЭПР феррицитохрома Р--450 в надпочеч- нитках крыс после введения кортикотро- пина (М + m отн. ед.; п 5-6) показано в табл. 1...
При изучении характера воздействия синактена-депо на интенсивность сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках крыс установлено следующее. Спустя 60 мин .после однократной инъекции препарата в дозе 2,5 ед/100 г массы крысы величина сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках снизилась на 45% (3,3+0,3 отн. ед, в контроле и 1,6+ +0,2 отн. ед. в опыте). Через 120 мин величина этого сигнала в надпочечниках опытных крыс возвращается к норме (4,2+0,6 отн. ед. в контроле и ,4 отн. ед. в опыте). Следовательно, при воздействии химических . веществ,, активизирз ощих функцию коры надпочечных желез, интенсивность сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках крыс снижается.
Синтетический г люкокортнконд дек- саметазон, как известно, является эсЬ- фективным блокатором секреции ЛКТГ гипофизом, угнетая тем самым функцию коры надпочечников. Установлано, что спустя 60 мин после однократной инъекции дексаметазона в дозе 2мг/- 100 г массы крысы интенсивность сиг-нала ЭПР феррицитохрома Р-450 в над- почечниках опытных крыс увеличивается на 50% (6,,,4 отн. ед. в контроле и 9,0+Рз2 отн, ед., в опыте). Через 120 мин величина этого сигнала в надпочечниках опытных крыс увеличивает - ся на 82% (5,0+0,2 отн, ед, в контроле и 9,1+0,2 отн. ед, в опыте). Следовательно g под влиянием химических веществ, вызывающих угнетение функции гипофизарно-надпочечникоБой сие- темы, интенсивность сигнала ЭПР феррицитохрома Р--450 в надпочечниках увеличивается.
Изменение интенсивности сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочеч- никах крыс после введения вштозена (50 мгк/100 г массы) и фенобарбита-. ла (8 мг/100 г массы) (М + m отн. ед, п 5) приведено в табл. 2.
Как видно из результатов, пред- ставленных в табл« 2, под влиянием стресса (инъекции физиологического раствора) наблюдается достоверное снижение величины сигнала ЭПР феррицитохрома в надпочечниках конт рольных животных, В таких условиях, как известно, усиливается процесс Ьсортикостероидогенеза Вилозен, по видимому, проявляет неспецифическое действие, оказывая кратковременный эффект на кору надпочечников, а фенобарбитал вызывает значительное увеличение интенсивности сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450, что свидетельствует о существенном влиянии этого бар- битурата на функцию надпочечных желе
Изменение интенсивности сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках крыс после введения дециса (60 мкг/100 г массы) и перметрина (60 мкг/1.00 г массы) (М + го, отн.ед.; и 5) приведено в табл. 3,
Данные, представленные в табл. 3, также свидетельствуют о том, чта увеличение секреции кортикотропиня под влиянием стресса вызьгоает снижение величины сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450 в надпочечниках контрольньп крыс. Детдис ( С 22 Н ,, В . NO.j) и/нер- метрин (с ,4 Н flO-jCl) существенного влияния на функцию коры надпочечньас желе не оказьгеают.
Так1-1м образом, проведенные исследования свидетельствуют о том, что из четырех химических веществ, действие которых на функцию коры надпочечных желез было неизвестно, только фенобарбитал оказывает отчетливое изменение интенсивности сигнала ЭПР феррицитохрома Р-450. Фенобарбитал угнетающе действует на функциональную активность коры надпочечных желез, оказы- вая репрессивное влияние на гнпофи- зарно-надпочечниковую систему. Для уточнения точки приложения действия фенобарбитала требуются дополнительные исследования.
Формула изобретения
Способ выявления химических веществ, направленно влияющих на функцию коры надпочечных желез, путем введения вещества лaбopaтopнo fy животному, удаления надпочечников и их исследования, отличающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения способа, надпочечники исследуют методом электронно-парамагнитного резонанса, определяют величину сигнала низкоспиновой окисленной формы цитохрома Р-450 и по ее изменению относительно контроля судят о наличии регуляторной функции химического вещества.
14273026
таблица 1
Продолжительностьвоздействия, мин
Н ± Шу отн ед
Контроль
20
60
120
,9±1,0
7,3±0,7
5,5±1,0
- Достоверность различий относительно контроля ,05
I
Т а б л а 2
Время воздей- М +. т, отн, ед,
ствия, мин1j
Контроль I Вилозён Фенобарбитал
205,1+0,4 3,7+0,3 10,1+0,8
604,2+0,4 7,9+0,8 10,0+1,5
120 3,7+0,3 4,6+0,5 10,7+0,8
Достоверность различий относительно контроля ,05.
Опыт
2,5±б,3 2,5±а,3 2,6+0,6 2,5±0,2 3,9±0,7 2,6±0,3 3,7±0,3 3,3±0,3 5,2+0,6 4,0+0,4 5,0+0,4 4,2tO,6
Достоверность различий относительно контроля ,05.
2, V2
Таблица
Фиъ,1
% н контролю
120 Вреня, пин
Фил. 2
