Способ стереоспецифического анализа триацилглицеролов Советский патент 1988 года по МПК G01N33/00 

00

о

СХ) СХ)

сх

Изобретение относится к масложи- ровой промышленности и касается способа стереоспе1 (ифического анализа триацилглицеролов.

Целью изобретения является повышение точности анализа путем повышения глубины фосфорилирования и повышения чистоты разделения продуктов фосфолиполиза.

Способ осуществляется следующим образом.

В коническую колбу на 50 мл помещают навеску триацилглицеролов 1 г и добавляют 4 мл t%-Horo раствора поливинилового спирта, 1 мл 22%-ного раствора хлористого калыц1я,7 мл аммиачного буфера ( + IN , рН 8). Смесь вьщерживают в термостате 10 мин при 40°С, перемешивая содержимое мешалкой, и затем вносят в колбу 0,25 г предварительно обезжиренной ацетоном панкреатической липазы. Реакцию ведут 20-30 мин при 40 С, постоянно перемешивая и добав- ляя через каждые 10 мин 1 каплю 4М гидроокиси аммония. Для контроля глубины гидролиза через каждые 10 ми и последующие 5 мин реакции отбирают пробу и анализируют ее тонкослойной хроматографией в системе растворителей петролейный зфир (40-60 С): ди- этиловый эфир 7:3 (по объему). После подъема фронта растворителей и высу- .шивания пластинки на воздухе проявляют пятна продуктов гидролиза в парах иода, обращая внимание на интенсивность пятна Sn-1,2-(2,3)-ди- aцилглицepoлoв, подвижность которого характеризуется коэффициентом ,3 При высокой активности липазы время гидролиза уменьшают до 5-10 мин, чтобы не допустить расщепления ди- .ацилглицеролов до свободных жирных, кислот и глицерина.

По достижении желаемой глубины гидролиза реакцию прерывают и добавляют к реакционной смеси 1-1,5 мл 4N соляной кислоты и продукты вьщеляют трехкратной экстракцией (по 10 мп) диэтиловым эфиром, эфирные вытяжки объединяют, промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции, сушат безводным сульфатом натрия, растворитель удаляют на роторном испарителе.

Продукты гидролиза разделяют препаративной тонкослойной хроматографией на пластинках (20x20 см) с сили

0

0

0

5

кагелем, содержащим 5% гипса (8 г сорбента на 1 пластинку), в системе петролейный эфир (40-60 С): диэтило- вьй эфир 60:40 (по объему).

К остатку гидролизата после удаления диэтилового эфира добавляют 10 МП хлороформа и по 1 мл этого раствора наносят на 10 пластинок. В системе растворителей гидролизат разделяется на следующие компоненты: нерасщепившиеся триацилглицеролы (Rf 0,6), свободные жирные кислоты, отщепившиеся от Sn-1- и Sn-3-поло- 5 жений (Rf 0,6), сумму Sn-1,2(2,3)- -диацилглицеролов (Rf 0,3) и 2-мо- ноацилглицеролы (Rf 0,07). Проявляют вещества, опрыскивая край пластинки 50%-ной серной кислотой и нагревая его или в парах йода.

Зоны силикагеля с веществом счищают с пластинок, переносят на воронку Шотта с фильтром № 4 и с помощью водоструйного насоса смывают липиды с силикагеля несколькими порциями диэтилового эфира. Часть каждой фракции отбирают, жирные кислоты анализируют ГЖХ.

Равенство кислотных составов нерасщепившихся и исходных триацилглицеролов служит доказательством того, что липазный гидролиз не сопровождается изомеризацией. Совпадение состава выделенных для Sn-1,2 (2,3)-ди- ацилглицеролов с рассчитанным теоретически доказывает их репрезентативность, т.е. отражает распределение кислот в исходных триацилглице- ролах.

Теоретический расчет состава Sn- -1,2(2,3)-диацилглицеролов % X в Sn-1,2(2,3)-диацилглицеролах равно 3/4 % X в ТАГ + 1/4 % X в Sn-2-моно- ацилглицеролах, где X - жирная кислота. . . ,

5

0

5

0

5

Жирнокислотный состав Sn-2-моно- ацилглйцеролов характеризует набор кислот Sn-2-положения.

Для .фосфорилирования, Sn-1,2(2,3)- -диацилглицеролов используют свежеперегнанный фенилдихлорфосфат. Навеску 0,07-0,12 г Sn-1,2(2,3)-диaцил- глицеролов растворяют в 0,5-1,0 мл безводного диэтилового эфира и охлаждают в льдосолевой смеси до (-10)- (-15) С. Охлажденный раствор вещества по каплям шприцем приливают к предварительно охлажденной до (-10)-

314

(-15) С смеси 2 мл безводпс го пнри- ,иина и 0,25-0,50 r-ui сисжеперег нанно- го .гторфосфата в атмосфере азота при изб : точнсм даплекии 0,15 MIfa. Реактивную смесь после встряхипания оставляют в этих условиях на 8-10 ч при 3-8°С,

Затем в Т йакциоин к) смесь L и 1)-фосфат ;лилфсноло 3 при охлал дении добавляют 5 мл пиридина, 3 нл диэти- лопого гофира и 5-7 капель дистиллированной воды., переносят в целительную воронку,, запо.гп-шнную 30 мл мет анола, 25 MJt дистиллирова)5иой воды 30 мл

ХЛОПОгЬорМЯ II 1 мл

натрия Спп 5 мл), Хлопофор; ;нь м раст

вер фосфЕ1Т иП г,;:-:ОТГ0.1Н|;-; О : } -:--У 1 У - от

промыпИ(,1х вод, хлор 5;ю1 1- N V ар;-;вг1 iOT п роторио;- испарителе тс-мггаратуре ие пьпие 5О С,

Для опрсче; енчя побочны продуктов

фосфорьЛИрОБаНИ5{ ;- О ЧИС- КИ Т.- :-1 1)

-(i) о рф g ти д е п ол о у с г и i гьгй хл OD о фор;.;:1ь;й 1)ап нот1 г1:осЛ)г ; ИгЛ1,лтанолов пропускаю1 лерс : колонку аалолненаую ;,nJi iKa:i ejieM ohico va колонк;; 12 см,

Г;Ка,;1Г р 1 СГпри заполпепр -; колонтл на верхний слой сорбента насыпают небольшой слой (2--3 мм) сухого карбоната нат- .рия, вносят хлороформный раствор фос фатидилфенолов, Колонку про1-:ъ ва от хлороформом5 отделяя непрореа.гировав- шие Sn-1,2(2,3)-диацилглицеролыэ затем системой растворителей xпopoфop i: метанол 9:1 (по объегп,) вымывают сумму L- и D фосфатидилфенслов, Чистоту продуктов контролируют тонкослойной хроматографией в систаме хлороформ :метанол ;25%-ная гидроокись ам мония 80:20:2 (по объему) В этой системе сумма L- и В-фосфатидилфено- лов имеет Rf О 56.

Проявляют фосфатидипфенолы реактт - вом ВаськовскогО; что слуяатт одно-временно качественной реакцией на фосфор.

Фосфолиполиз L-- и 1)-фосфати,цклфе нолов проводя , лобавпяя к 50-100 мг фосфатщц-шфенолон в ч О мл диэтипово- го эфира 0,2 мл 0,1 М раствора хлористого капыкя и растпор 20 мг яда гюрзы (йюсфопипаза в 1 мл/трис- -буфера с рН 5,0, Полноту гидролиза контролируют тонкослойной хроматогра88фмей на силикаг-епе в системе хлоро- формгметаиол:25%-ная гидроокись аммония (80:20:2).

R Л Казанной системе продукты фос-

фо 1иполиза имеют следующую хроматограГпгческую подвижность: нерасщенив- шиеся D-фосфатидягтфенолы - Rf 0,6, свободные кислоты, отщепившиеся из

Sri--2 .положения L-фосфатидилфенолов - Rf 0,4, лизофосфолипиды - Rf 0,05.

Фосфалипо.пиз заканчивают после нрекрапшкия роста выхода свободных л нрных кислот и лизoфocфoлIш щoв,

Реакционную ,смесь упаривают на ро T-opiiOM испарителе при температуре ие nj.iLie -iO С, добавл5тя неОолыаие партии исизо :п длл уд;;лй ;пл в виде азеотро- n;i основного кол .пчества воды. Затем

остаток продуктов фосфолиполиза после даленмг Д 5этилоного эфира и воды растворяют в смеси, состоящей из Oj5 K-i хлорофор ма и 0,5 мл метанола и ;;аз;тслгс:пт препаративной тонкослой-

ИО11 хроматографией последовательно в л,пух с:;сте.ах: 1) гексан:диэтиловьй зфир (60;- iO по объему), вьделяют сво- (Ч}тг1П: е жирные кислоты, имеющие хро 1-; гс1Грпф1 ческую подвижность в этой

ci -vrei-;e (Rf - 0.6). 2) шороформ:ке- таиол:20%-ная гидроокись аммония в соотношении 80:20:2 (по объем О. В этой систеьге выделяют полярные фракции: Л153ОФОСФОЛИПИДЫ (Rf 0,2) и

ijspacFienHBiiniecH D-фосфатидилфенолы

(Rf 0,6У,

Зоны сорбента, содержащие свободные жирные кислоты, счищают и десор- бируют нескольк11ми порциями диэтнлового эфира. Элюат осушают, метилируют -: анализиру от газожидкостной хроматографией.

Полосы селикагеля с D-фосфатидил- фенола№1 и с лизофосфолинидами счиiiiaioT в отдельные колбы и добавляют

кадсцую по 3 МП 0,5 М метанольного раствора гидроокиси калия. Спустя 15 мин к ммлам добавляют по 1 мл 1N соляной кислоты и полученные частично метилированные жирные кислоты выделяют экстракцией петролейным эфиром (АО--60 с) (3 раза по 5 in) .

Сгчесь фильтруют через фильтр № 4 воронки Шотта, из приемной колбы пипеткой отбирают в другую колбу слой петропейногс эфира, содержащего жир- нъ е кис,лоты, растворитель упаривают, кислоты дометилируют диазометаном и анализируют П1(Х,

Состав свободных жирных кислот, полученных при расщеплении лизофос- фатидилфенолов, не должен отличаться от состава кислот Sn-2-моноацил- глицеролов, полученных при липолити- ческом гидролизе. Совпадение состав ов подтверждает отсутствие изомеризации в процессе выделения Sn-1,2(2,3)-ди- ацилглицеролов и, следовательно, их репрезентативность.

Из двух продуктов фосфолиполиза состав кислот лизофосфатидилфенолов непосредственно отражает набор жирных кислот 1 положения триацилглицеролов. Набор кислот в Sn-3-положении получают расчетным путем двумя способами: 1) Sn-3-З (исходные триацилгли- церолы) - (лизофосфатиды) - (2-моноПараллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. 1).

Из результатов, приведенных в табл. 1, видно, что при избыточном давлении в атмосфере азота при снижении температуры в начальный период фосфорилирования до -10 С и разделеНИИ продуктов фосфолиполиза последовательно в двух системах глубина фосфорилирования увеличивается на 25%, содержание продуктов деструкции г уменьшается на 20%, длительность

процесса сокращается на 8 ч и обеспечивается полное разделение продуктов фосфолиполиза..

Пример 2. 0,1г 1,2(2,3)- -диацилглицеролов, полученных путем

ацилглицерины), 2) Sn-3-2 (D-фосфати- 20 гидролиза триацилглицеролов панкреа- дилфенолы)-(2-моноацилглицеролы). тической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота при давлении 0,13 МПа, температуре - 11 С выдержали смесь при +7°С в течение фосфорилирования и образование побоч- 25 9 ч до завершения реакции. Продукты

При выбранных режимах обеспечивается увеличение глубины фосфорилирования, снижение деструкции субстрата

ных продуктов реакции, уменьшение продолжительности анализа, повышение чистоты выделяемых продуктов фосфо-, липолиза. Избыточное давление нейт- /

рального газа над реакционной средой, с

одной стороны, предотвращает окислительные процессы в продолжительной реакции фосфорилирования, а с другой препятствует конденсации влаги в реакционную смесь из газового состава колбы, что улучшает полноту фосфорилирования. Двухстадийный температур- ньй режим фосфорилирования обеспечивает отсутствие побочных продуктов реакции на первой стадии и повьппение глубины на второй стадии. При выходе за пределы параметров способа точность анализа остается не уровне прототипа.. .

Пример 1. О,1 г 1,2 (2,3)- -диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фенилдихлорфосфатом в токе азота при давлении 0,10 МПа, температуре - ЮС выдерживали до завершения реакции при +5 С в течение 8 ч. Полученные фосфолипиды после фосфолиполиза разделяли тонкослойной хроматографией последовательно в двух системах растворителей гексан:диэтиловый эфир (60:40), хлороформ:метанол:20%-ная гидроокись аммония (80:20:2).

фосфолиполиза последовательно разделяли в системах растворителей гексангдиэтиловый зфир (60:40), хлороформ: метанол :20%- ная гидроокись амПараллельно проводили эксперимент ло режимам, указанным в прототипе (табл. Г).

Из данных, приведенных в табл. 2, 35 видно, что при названных условиях глубина фосфорилирования увеличивается на 25%, содержание продуктов деструкции снижается на 10%, длительность процесса фосфорилирования сок- 40 ращается на 9ч, обеспечивается абсолютное разделение продуктов фосфо- липолиза.

П р и м е р 3. 0,1 г 1,2(2,3)-ди 45 ацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали I нилдихлорфосфатом в токе азота при

давлении 0,15 МПа, температуре - 12 С 50 вьщерживалй при в течение 10 ч до завершения реакции, продукты фосфолиполиза последовательно разделяли в системах растворителей: гексан:ди- этиловый эфир (60:40), хлороформ:ме- 55 танол:20%-ная гидроокись аммония (80:20:2).

Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. 3).

Из результатов, приведенных в табл. 3 видно, что в данном случае глубина фосфорилирования увеличивается на 25%, содержание продуктов дест рукции снижается на 20%, длительност процесса снижается на 8 ч, обеспечивается абсолютное разделение продуктов фосфолипсшиза,

Пример 4. 0,1 г 1,2(2,3)- -диацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреатической липазой, фосфорилировали фе нилдихлорфосфатом в токе азота при давлении 0,09 МПа, температуре С выдерживали при 10 С до завершения реакции в течение 7 ч, продукты фос- фолиполиза последовательно разделяли в системах гексан:диэтш1овый эфир (50:50), хлороформ:метанол (75:25). Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе Стабл. 4).

Из результатов,приведенных в табл. 4, видно, что при осуществле- НИИ метода по режимам, в.ыходящим за оптимальные значения, из поставленны целей достигается только одна - снижение содержания продуктов деструкции, в то время как глубина фосфори- лировагдая, чистота разделения продукта остается на уровне прототипа.

Пример 5. 0,1 г 1,2(2,3)- -дйацилглицеролов, полученных путем гидролиза триацилглицеролов панкреа- тической липазой, фосфорилировали фе нилдихлорфосфатом в токе азота при давлении 0,20 МПа, температуре , вьцт,ерживали реакционную смесь при +5 С в течение 14 ч, продукты фосфо- липолиза последовательно разделяли в системах гексан-диэтиловый эфир (70:30), хлороформ:метанол (85:15).

Параллельно проводили эксперимент по режимам, указанным в прототипе (табл. 5).

Из результатов, приведенных в . табл. 5, видно,что при осуществлении метода по режимам, выходяпц1м за границы оптимальных режимом, не дости- гаются чистота разделения продуктов

фосфолиполиза и глубина фосфорилирования.

Формула изобретения

Способ стереоспецифического анализа триап лглицеролов, включающий гидролиз пробы панкреатической липазой, вьщеление из продуктов гидроли- за 2-моноацилглицеролов и смеси 1,2 (2,3)-диацилглицеролов препаративной тонкослойной хроматографией, определение жирно-кислотного состава 2-моноацш1Глицерс1ЛОВ в 2-положении газожидкостной хроматографией, фос- форилирование смеси 1,2 (2,3)-диацил глицеролов фенилдихлорфосф|атом при . отрицатепьных температурах с последующим нагревом до положительных температур и выдержкой в течение нескольких часов, вьщеление из продуктов реакции смеси L- и D-фосфати- диЛфенолов колоночной хроматографией, их гидролиз фосфолипазой Aj, выделение из продуктов фосфолиполиза L-лизофосфатидилфенолов препаративной тонкослойной хроматографией в системе растворителей хлороформ:метанол, определение их жирно-кислот- ,ного состава в 1-положении газожид- костной хроматографией и определение жир но-кислотного состава в 3-поло- жении расчетным путем, о т л и ч а - ю щ и и с я тем, что, с целью повышения точности анализа путем .увеличения глубины фосфорилирования и повышения чистоты разделения продуктов фосфолиполиза, фосфорилирование ведут в атмосфере азота под давлением 0,10-0,15 МПа при температуре (-10) - (-12) С и нагрев ведут до TeMnepaTy ры 5-8 С, при вьщелении продуктов фосфолиполиза в систему растворителей хлороформ:метаНОЛ дополнительно вводят 20%-ную гидроокись аммония, а в качестве второй системы растворителей используют гексан и диэтиповый эфир при соотношении растворителей 80:20:2 и 60:40 по объему соответственно.

Глубина фосфорилирования, % от суммы диа1Д1лглицеролов

Содержание продуктов деструкции, %

Длительность процесса фосфорилирования, ч

Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, %

Глубина фосфорилирования, % от суммы диацилглицеролов

Содержание продуктов деструкции, %

Длительность процесса фосфорилирования, ч

Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, %

Т а б л и ц а 1

65

90

25

10

70-80

100

Таблица 2

65

90

25

15

70

100

.Способ

Прототип Предлагаемый при Р 0,15 МПа t -}2°С t +8 С

I . - .

ия, % лов 65 90

фосфо18 10

дуктов

70 100

Т а б л и ц а 4

Способ

Прототип Предлагаемый при Р 0,09 Ша t t н-Ю с

Глубина фосфорилирования,

% от суммы диацилглицеролов

Содержание пр1одуктов

деструкхщи, %

Длительность процесса фосфорилирования, ч

Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, %

65

18

70

13

Показатели

Глубина фосфорилирования,

% от суммы диацилглицеролов

Содержание продуктов

деструкции, 7,

Длительность процессов фосфорилирования, ч

Чистота разделения продуктов фосфолиполиза, %

Редактор М.Циткина

Составитель В.Гордеев

Техред л,Сердюкова Корректор М.Васильева

Заказ 5338/47

Тираж 847

ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

1430888

14 Таблица 5

Способ

Предлагаемый при Р 0,2 МПа t -З С t

65

15

14

70

Подписное