Способ определения удельной активности липаз в реакциях переэтерификации жиров и масел Советский патент 1990 года по МПК C11C3/10 

31

гексаноМо Из экстракта выделяют две пробы одна из которых используется для определения количества гидролизо вавшихся триглицеридов, а другая - для определения кислотного состава смеси после переэтерификации. Количество гидролизовавшихся триглицеридов находят в результате упаривания гексана, растворения остатка в бензоле, взаимодействия его с родамином 6Ж и определения оптической плотности полученного раствора при Л 515н

Для определения кислотного состав смеси пробу гексанового экстракта наносят на пластину с закрепленным слоем силикагеля КСК, пропитанного нитратом серебра, хроматографируют и вьщеляют фракции, которые- соответствуют насыщенным триглпцеридам и на сыщенным этиловым эфирам. Затем проводят алкоголиз выделенных триглицеридов и эфиров, повторное их хрома- тографирование на силикагеле и количественное определение кислотного состава методом газовой хроматографии, откуда находят долю непрореаги1 ровавшего внутреннего стандарта.

Удельную активность липазы определяют с учетом гидролизовавшихся в процессе переэтерификации триглицеридов по формуле

м(1 - к

Эч

м/

0

5

п

5

0

5

чествах за исключением фермента. После 24 ч реакцию останавливают добавлением 1 мл 0,1 N НС1 в этаноле (ин- гибируют фермент). Затем к смеси добавляют 6 мг Хроматографического стандарта - этилового эфира бегеновой кислоты. Смесь экстрагируют 4 мл гексана. Затем 0,5 мл гексанового слоя наносят на пластинку 6кб см с закрепленным слоем силикагеля КСК с размером частиц 3-7 мкм. Пластинку перед использованием пропитывают нитратом серебра погружением в его насыщенный раствор в этаноле при 18°С.

Хроматографию проводят в чистом хлороформе при -12 С. Далее пластинки опрыскивают 0,01%-ным раствором родамина 6Ж в 96%-ном этаноле и, проявляя под УФ-лампой, собирают две полосы с ,7 и 0,9, что соответствует насыщенным ТГ и насыщенным этиловым эфирам. С силикагеля липиды элюируют 2 мл хлороформа, упаривают и растворяют в 1 мл бензола, добавляют 0,5 мл 1%-ного раствора натрия в этаноле и выдерживают на водяной бане 15 мин при 50°С, после чего добавляют 1,5мл 5%-ного хлористого водорода в этаноле и выдерживают при той же температуре 30 мин. Смесь упаривают до объема 0,5 мл, наносят на пластинку и хроматографиругот в бензоле, пятно эфиров (,7) элюируют 3 мл хлороформа. Далее проводится анализ эфиров на газовом хроматографе при условиях:

Изобретение относится к масло жировой промышленности и может быть использовано при определении степени переэтерификации жиров и масел. Целью изобретения является повышение точности результатов определения удельной активности липаз в реакциях переэтерификации жиров и масел. Цель достигается в результате использования в качестве внутреннего стандарта синтетического, не встречающегося в природе, триглицерида с нечетным числом атомов углерода, дополнительного отделения части пробы перед алкоголизом, в которой определяют количество гидролизовавшихся в процессе переэтерификации жиров и масел путем проведения реакции с родамином 6Ж в бензольном растворе и спектрофотометрирования по полосе поглощения при 515 нм, определения удельной активности липаз по формуле A=M(1-K-A/M)/Л^.Т, где M - общее количество триглицеридов в смеси, мкМоль, K - доля непрореагировавшего внутреннего стандарта, A - количество гидролизовавшихся триглицеридов, мкМоль, Л - количество липазы, мг, T - время реакции, ч.

где А - удельная активность липазы,

мкмоль/мг белка чJ М - общее количество триглицерйДОВ В СМеСИ, МКМОЛЬ ,

К - доля непрореагировавшего

внутреннего стандарта от исходного количестваJ а - количество гидролизовавшихся

триглицеридов, мкмоль Л - количество липазы (в расчете

на 100%-ный белок), мг; Т - время реакции, ч. Пример. 30 мг оливкового масла смешивают с 6 мг трипентадекано- атглицерина. Объем доводят до 1 мл гексаном и добавляют 2 мг препарата панкреатической липазы. В препарате 90% белка, т.е. чистого белка добавляют 1,8 мг. Процесс проводят ,при „ постоянном перемешивании при 37вС в течение 24 ч. Параллельно с этим ставится контрольный опыт, где присутст вуют все компоненты и в тех же коли

5

д

где

Температура о

колонки,

С

0

Температура испарителя, °С Температура детектора, °С Расход газа-носителя, Расход водорода, дм3/ч Расход воздуха,

Шкала самописца, мВ

Объем вводимой пробы, мкл

210

240

220

3,0

2,4

24

0,9

1,0

где

Рассчитывают долю непрореагировавшего внутреннего стандарта:

где

}Ј

н

V , Ь - V .

S н, к

К - V

,, - л,

- высота пика внутреннего стандар га (грипентадеканоат, 10

v-1558872

глицерин, выделенный с фракцией насыщенных ТГ и насыщенных этиловых эфиров при хроматографии на сорбенте с нитратом серебра, гидролизован до жирных кислот, которые перевели в эфиры - этиловые эфиры пен- тадекановой кислоты), мм высота пика хроматографи- ческого стандарта (этиловый эфир бегеновой кислоты) , мм;

отношение высот пиков стандартов до начала реакции (контроль), ед; высота пика внутреннего стандарта после реакции, мм высота пика, хроматографи- ческого стандарта после реакции, мм,

отношение высот пика стандартов после реакции, ед, доля непрореагировавшегб внутреннего стандарта (три- пентадеканоатглицерина) от

15

20

25 с

р

+Mf м

м,

исходного количества,1

остаток трипентадеканоат- глицерина в смеси после реакции переэтерификации с учетом реакции гидролиза, мкмоль-,

количество трипентадекано- атглицерина в смеси до реакции, мкмольJ количество трипентадекано- атглицерина, подвергнувшегося гидролизу, мкмоль.

Далее по соотношению пиков на хро- матограмме рассчитывают долю не прореагировавшего трипентадеканоатглицерина в смеси после реакции:

30

К - КА - . - К, h, Et

0,289.

Степень переэтерификации жировой смеси определяется по формуле

Р MI KiMil М

F м к м

где Р - степень переэтерификации жировой смеси. Очевидно, что дробь

35

40

45

k

М

где а М Число молей гидролизовавшихся ТГ в смеси находят по содержанию в смеси жирных кислот с помощью метода спек- трофотометрии. Для этого после экстракции переэтерифицируемой смеси гексаном 0,1 мл гексанового слоя упаривают, разбавляют 1,5 мл бензола и добавляют 1,5 мл цветного реагента. Смесь выдерживают 30 мин, после чего измеряют оптическую плотность при 515 нм. При этом в кювету сравнения вводят раствор 1,5 мл бензола и 1,5мл цветного реагента.

Цветной реагент готовится следующим способом: 20 мг родамина 6Ж растворяют в 20 мл 0,2 М калий-фосфат- 50 ного буфера с рН 11. Затем смешивают с 200 мл бензола, после чего бензольная часть отделяется, хранится в сосуде над щелочью (исходный реактив). При определении используют спектро- количество всех гидролизовав- гс фотометр.

По калибровочному графику, который представляет собой зависимость оптической плотности от концентрации жирной кислоты в кювете, на основанииI

а М

шихся ТГ переэтерифицированной смеси, мкмоль;

общее количество ТГ смеси,

мкмоль.

6

Удельная активность липазы р реакции переэтерификации определяется по формуле

М(1 - К

- -)

М мкмоль

Л.Т

мг белка.ч

10

Мол.м. смеси находят как сумку всех мол.м. ТГ, умноженных на их долю в смеси:

М

с,,+сгрЈ+с,рэ + .

где С,Сд,С - доли молекулярных типов ТГ в смеси, Pi ,Pi ,Р} - мол.м. ТГ, г.

Доля трипентадеканоатглицерина в смеси составляет 0, 167 . .(6/(30+6), доля оливкового масла 0,833.

Мол.м. трипентадеканоатглицерина 764 г. Ыол.м. оливкового масла (три- олеатглицерин) 884 г. Для определения моль ТГ в смеси делят количество ТГ смеси (36 мг) на мол.м. смеси, получают А 1,67 мкмоль.

Далее по соотношению пиков на хро- матограмме рассчитывают долю не прореагировавшего трипентадеканоатглицерина в смеси после реакции:

К - КА - . - К, h, Et

0,289.

35

40

45

i

полученных спектрофотометрических данных определяют количество мкмолей жирных кислот в анализируемой кювете Калибровочный график строят, используя стандартные растворы жирных кислот, в данном примере оптическая плотность ,295 ед.

Пр графику находят количество жир ных кислот (Г) в кювете (Р ,0,162 мкмоль), образовавшихся в результате гидролиза:

Г 8,1 мкмоль.

I

Количество панкреатической липазы (в пересчете на чистый белок) 1,8мг. Используют панкреатическую липазу. Время реакции 24 ч. Рассчитывают удельную активность данного препарата панкреатической липазы в реакции переэтерификации:

А 0,50

мкмоль мг белка

ч.

За окончательный результат принимают среднее арифметическое двух определений. Относительное расхождение между параллельными определениями превышает 5%.

Таким образом, способ определения удельной активности липаз в реакциях переэтерификации повышает точность и воспроизводимость результатов определения более чем в два раза (в известном способе погрешность анализа составляет 13%) за счет того, что исключается перекрывание хроматогра- фических пиков внутреннего стандарта и триглицеридов пробы жиров и масел, а также за счет того, что при определении удельной активности липаз учитываются гидролизовавшиеся ,в процессе переэтерификации триглицериды.

Редактор Н.Яцола

Составитель Ю.Скорбов .

Техред М.ХоданичКорректор О.Ципле

Заказ 814

Тираж 360

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

5588728

Формула изобретения

10

15

Способ определения удельной активности липаз в реакциях переэтерификации жиров и масел, включающий введение в пробу жиров и масел внутреннего стандарта, проведение переэтерификации, алкоголиз продуктов переэтерификации, выделение фракции насыщенных триглицеридов методом тонкослойной хроматографии, определение жирнокислотного состава этой фракции методом газожидкостной хроматографии и расчет удельной активности липазы по изменению концентрации внутреннего стандарта, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности результатов определения, в качестве внутреннего стандарта используют синтетический, не встречающийся в природе, триглицерид с нечетным числом атомов углерода, перед алко- голизом дополнительно отделяют часть пробы, в которой определяют количество гидролизовавшихся в процессе переэтерификации жиров и масел путем проведения реакции с родамином 6Ж в бензольном растворе и спектрофотометри- рования по полосе поглощения при 515 нм, а определение удельной активности липаз осуществляют по формуле

20

25

30

35

м(1 - к - 2)

М Jbf

где М - общее количество триглицеридов в смеси, мкмоль; К - доля непрореагировавшего

внутреннего стандарта} а - количество гидролизовавшихся триглнцеридов, мкмоль;

Л - количество липазы, мг; Т - время реакции, ч.

Подписное