Способ определения мутаций в культуре клеток Е. coLI WP2/тRр-/ и S.тUрнIмURIUм(нIS-) Советский патент 1988 года по МПК G01N33/48 

3U42090

количественное изменение

л ч л

роста клетонной популяции.

Первоначально однородную экзотро- фическую клеточную популяцию можно разделить на генетическом уровне,с помощью воздействия мутагена на экзо трофическую и прототрофическую подгруппы. С помощью фотометра, наблюда рост указанных популяций, которые могут находиться в одной общей кювете, можно Определить по кривой зависимости роста популяции от времени мутагенность образца, токсичность, природу токсичности (бактериостати- ческая, бактерицидная), распад токсического соединения в процессе исследования, а также факторы роста, если они присутствуют в образце. При этом необязательно работать с самим образцом или экспериментальными организмами .

Для установления частоты самопроизвольных мутаций (так называемая основа) необходимо сравнить образец с другими подобными, но не .содержащими мутагенов. Оперативность способа оценивают с помощью соответствующего образца, содержащего известные мутагены. В зависимости от исследуемого образца проводят несколько паралельных, серий и/или его разведений,

В микробиологическом тесте на мутагенность можно использовать генетически точно определенные аминокислотные экзотрофические меченые бактериальные штаммы. Изменение в генотипе, . вызванное мутацией, обнаруживают как фенотипически измененные потребности, в факторе роста так, что клетки, на которые мутация воздействовала направленно, становятся незавсимыми от влияния факгора роста аминокислот.

В предложенном способе первоначально генетически однородную популяцию бактерий подвергают воздействию мутагенов, в результате чего часть популяции мутирует из зкзотро- фов в прототрофы. Увеличение мутности в таким образом полученной подгруппе можно обнаружить спектрометрически даже при субминимальном уров- ,не с помощью вертикального фотометра FP-901, поскольку изменения объема жидкости и осаддение бактериальных клеток не влияют на результат измерения поглощающей способности.

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

Когда все факторы роста аминокислоты были израсходованы, способность к росту сохраняли только клетки, содержащие мутацию. Чем больше введенная популяция клеток - мутантов в начале эксперимента, тем быстрее они достигают спектрометрически определяемой плотности. Время от начала эксперимента до момента измерения обратно пропорционально мутагенной активности данного образца. Кривая зависимости роста популяции от исходной поглощающей способности (так называемая кривая роста), дает, кроме информации о мутагенности образца, также сведения о факторах роста, содержащихся в нем, если они имеются.

На фиг.1-3 показаны различные кривые роста (уровни поглощающей способности в функции от времени в логарифмическом масштабе).

Способ осуществляют следущим образом.

В тесте используют Е.coli WP2 (trp) и Salmonella typhimurium (his) или любые другие удобные аминокислотные экзотрофические меченые штаммы. Рост и дифференциацию клеточных популяций регистрируют с помощью вертикального спектрофотометра FP-901,причем изменение, уровня жидкости и осаждение клеток не влияют на результат измерения поглощающей способности. .

Исследование и рост клеток происходит при в термостате в наборе кювет по 1 кювете на образец, на среде Davis-Mingioii, Vogel-bonner или любой другой подходящей субминимальной жидкой среде. Исходный размер клеточной популяции , ее помещают в спектрофотометр FP-901 в собственном сосуде, в котором увеличение числа клеток вызывает изменение поглощающей способности dA oj/IO клв ток 0,001. На стадии мутагенизации клетки делятся экзотрофически под действием фактора роста 5 раз. После того как фактор роста израсходован, рост экзотрофических клеток заканчивается, а клетки, мутиров авшйе в прототрофы, продолжают расти. Чем больше процентное содержание прототрофичес- ких клеток во всей популяции, тем быстрее они достигают плотности, которую можно измерить.

Время, прошедшее к моменту измерения, используют как количественную

оценку мутагенной активности в

с нетоксичными образцами. В зависи- мости от скорости роста опытных ор- ганизмов, продолжительность исследования различна, в случае E.coli и S.typhimurium она не превьшает 24 ч.

Кривая, полученная как функция от величины поглощающей способности, является иллюстрацией диакустическо- го роста.

На фиг.1 кривая 1 соответствует незамедпенному росту (нетоксичность, степень выживаемости 100%), кривая 2 соответствует степени выживаемости 80%, кривая 3 - степени 50% и кривая 4 - степени в.ыживаемости 20%. Процентное содержание погибших клеток можно вычислить по формуле

1

2t7gt

где п - процентное содержание в исходной популяции (1.000); время, прошедшее к моменту, когда превьшен нулевой уроt gt вень (tд , t время роста

tp; (t, - t,

я

На фиг.2 кривая 5 показывает не- замедпенный рост, кривая 6 - бакте- рицидность (степень бактерицидности 50%), кривые 7 и 8 - неразрушающиеся бактеростатические вещества, кривая 9 - разрушающиеся бактериостатически вещества.

На фиг.З 1, - 1д (а) показан расчет части ростового фактора.

По графику двухфазной кривой роста можно определить следующие факторы:

1)токсичность препарата ic начального момента первой логарифмической стадии (фиг.1); .

2)природу токсичности образца (бактерицидность, бактериостатичг ность, разрушающую бактерирстатичность) по виду кривой роста первой логарифмической стадии;

3)скорость роста-немутировавших клеток по величине угла (К,), который образует кривая роста первой логарифмической стадии (фиг.З);

4)скорость роста мутантов по величине угла (К.) второй логарифми- ческой стадии (фиг.

5)факторы роста, при их наличии, присутствующие в препарате, по величне поглощения на стадии плато 1.

1442090 случае

Число дополнительно полученных

мутантов, вызванных факторами роста, определяют по формуле

Fp xgxr,

где Fp - излишек мутантов после по- V требления излишков факторов

роста;

g - число генераций клеток; г - количество мутантов в одной, генерации, умноженное (х) на размер популяции (S),

I V e .исходный уровень остатка i

S. D, - DO S, , . 1, конечный уровень остатка

- Dj - DO

g - число генераций клеток - D,- DO/D k,/t5 -t -kyt5-t;

6)мутагенность препарата по длине кривой плато 1 (фиг.З);

7)число мутантов в момент време25 ни

t о путем экстраполяции соотноше

ния степеней роста по первой и второй логарифмических стадий;

D - обнаруженный размер конечной популяции; а

k,/t5-t | - число делений на первой логарифмической стадии;

b

-С5-число делений на стадиях плато 1 и второй логарифмич-еской стадии;

X - число мутантов в момент времени to;

D

Пример. Проведение теста. Культивационная среда 965 мкл Бактериальные клетки 5 мкл Образец10 мкл

Ферментативная активизирующая система S-9 20 мкл (если требуется).

Указанные компоненты помещают в кювету объемом 1 мл, перемешивают с помощью вибратора 15 с, помещают в термостат при +37°С, выдерживают в спектрофотометре FP-901 при длине волны 405 нм, затем выдерживают 20-24 ч, в течение этого времени поглощаняцая способность образца из- ,

71

меряется при длине волны 403 нм в соответствии с эаппанированньт режи-f мои работы.

Исходя из степени поглощения, строят кривую роста как функцию времени по которой можно получить мутагенность препарата и некоторые другие параметры.

НефелометрическШ тест бактери- . «алчной мутагенности удобен для всех видов исследований мутагенности, в кофорых необходимо установить, способен ли исследуемый образец взаимодействовать с ДНК с образованием мутаций.

442090

Формула

изобретения

Способ определения мутаций в культуре клеток E.coli WP2 (trp-) и S.typhimurium (his) путем инкубации однородной культуры клеток с мутагеном с последующим определением наличия мутирующих подпопуляций культуры клеток, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет уменьшения количества стадий, пробу исследуют н жидкой куль- туральной среде с помощью спектрофо- тометра с вертикальным ходом лучей и по изменению оптической плотности определяют мутацию клеток.

Изобретение относится к способу осуществления теста на мутагенность. Цель изобретения - упрощение способа. Исследование и рост клеток происходят в термостате. При этом используют субминимапьную жидкую среду. Рост и дифференциацию клеточных популяций регистрируют с помощью вертикального спектрофотометра. Тест на мутагенность используют как экспресс- тест веществ предполагаемых карцино- генов. 3 ил. ствию мутагенного вещества, то. у неге также возможно развитие рака. В предложенном способе изменение мутности, вызванное изменением вязкости различных клеточных кланов, измеряют как изменение оптической плотности с помощью вертикального фотометра на определенной дпине волны и количество клеток в популяциях, на которые разделился клан, определяют как оптическую плотность. С помощью вертикального фотометра можно точно определить количество клеток в популяции бактерий как оптическую плотность, при том что результат измерений не зависит от осаждения клеток или изменения объема жидкости. Кроме того, измерение можно проводить с помощью вертикального флюрометра, нефелометра, люминометра ипи любого другого прибора, который может реI О) N( 4 tC О CD CM

to

Ai,os

и

V, ti i3 и is is

tfftt t/n-z ifft.i

Редактор M.Циткина

TI I

Фиг.з

Составитель Е.Колмакова

Техред Л.Олийнык Корректор С.Черни

5

tstf,

Фиг. 2

17

A.

(0:A

tfftt t/n-z ifft.i

TI I

5 fifDo