Способ выделения мутантов дрожжей,поглощающих из среды и включающих в днк экзогенные нуклеотиды Советский патент 1981 года по МПК C12N15/00 

чение 3-4 дней. Мутанты, способные поглощадь ТМФ, возникают спонтанно с частотой 2 и под действием этилметансульфоната 4.10. Селекция мутантов проводится при рН 4-6. Указанный способ позволяет получать мутанты дрожжей, усваивающие из среды ТМФ. Методом ступенчатого отбора получают мутанты, способные расти в присутствии ингибиторов синтеза ТМФ на концентрациях ТМФ от 00 мг/.1л до 10 мг/л. Наиболее эффективные мутанты применяются для мечения ДНК дрожжей тимидицмонофосфатом (ТМФ) и его аналогами (йоддезоксиуридинмонофосфат, бромдезоксиуридинмонофосфат), 15 состав которых входят все возможные радиоактивные изотопы (Н-ТМФ, С-ТМФ, Ф, Ф-ТМФ, 51-УМФ). Hpi этом достигаются высокие удельные активности изотопов в ДНК.

Известпый способ получения ТМФ-усваивающих мутантов не дает возможности включать в ДНК весь снектр нуклеотидов, так как используемые ингибиторы тимидилатсинтетазы не позволяют решить задачу включения в ДНК дрожжей любых нуклеотидов, как ниримидинов, так и пуринов. Кроме того, этот способ требует использования дорогостояпдего и невыпускаемого отечественной промышленностью ингибитора (а.миноптерииа).

Дель изобретения - выделение мутантов е расширенным спектром поглощения нуклеотидов и упрощение спосо-ба.

Поставленная цель достигается тем, что Б способе выделепия мутантов дрожжей, поглощающих пз ереды и включающих в ДНК экзогенные нуклеотиды, путем исследовапия селектирующ,его фактора, обработки мутагеном, высева микроорганизмов на питательную среду, содержан1ую источник углерода, минеральные соли с добавлением нуклеотида, необходимого для отбора мутантов, способных поглощать этот нуклеотнд, выращивания известным способом с последующим отбором мутантов с целевыми свойствами, предусмотрено использование в качестве селектирующего фактора мутаций ауксотрофности по урацилу и адениыу, концентрацию -микроорганизмов берут клеток на чашку Петри, при этом из пуклеотидов добавление уридинмонофоефата (УМФ) или аденозинмонофосфата (АМФ) в концентрации 1-2 мМ, и проведение отбора мутантов но величине выросших колоний мутантов с последующим культивированнем их в жидкой питательной среде, содержащей 0,25-2,0 мМ УМФ или АМФ.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что биосинтез УМФ или АМФ блокируется мутациями ауксотроф1 ости по урацилу или адепииу. При этом на минимальной среде с УМФ или АМФ могут расти только мутанты, способные усваивать эти нуклеотиды нз среды роста. Для получения мутантов на минимальную среду с добавкой уридинмонофосфата (1 ) наносят культуру дрожжей генотипа а ura.x с концентрацией 10 клеток/чашку. Затем чашки облучают УФ-лучами при выживаемости клеток 10% и инкубируют нри в течение 7-10 дней. Далее отбирают 50 наиболее крупных колоний для дальнейшего анализа. Аналнз проводят по следующей схеме. В стерильные пробирки вносят 2 мл жидкой мини.мальной среды с различными концентрациями УМФ (О, 0,25; 0,5; 0,75; 1,0; 1,5; 2,0) мМ. В пробирку вносят суспензию отобранных мутантов ( кл/мл), инкубируют при 30°С в течение 3 дней. Но степени помутнения среды судят о способ, ности роста полученных мутантов на среде с различными концентрациями УМФ. Затем отбирают мутанты, способные активно расти на среде с 0,25 мМ УФМ. Эти мутанты используют для роста исключительно экзогенные пиримидиновые нредщественники нуклеиновых кислот. После этого

клетки наиболее эффективного мутанта выращивают на среде с радиоактивным предшественником ДНК. Для этого двухсуточную культуру клеток вносят в минимальную жидкую среду с концентрацией УМФ

либо 0,25, либо 1,0 мМ. При малых концентрациях УМФ (0,25 мМ) количество клеток на 1 мл составляет при больших концентрациях (1,0 м/И) -101 Обе используемые концентрации УМФ обеспечивают лишь минимальные потребности клетки в пиримидиновых предшествен11иках нуклеиновых кислот. Известно, что количество УМФ, используемое клеткой дрожжей для синтеза РНК, примерно в 50 раз больще, чем для синтеза ДНК. А дезоксинуклеотиды в основном включаются в ДНК. Поэто.му соотношение меченых и немеченых пиримидинов в ДНК значительно выше, чем в среде роста. Так как недостающее количество пиримидиновых предшественников ДНК восполняется в результате биохимических реакций из УМФ, то для роста клеток не требуется добавки нерадиоактивных пиримидиноБЫх предшественНИКОВ ДНК. Радиоактивный предшественник ДНК с максимальной удельной активностью добавляется в среду роста в конечной концентрации 10-100 мкКи/-мл. После 40 ч выращивания клетки отделяют

от радиоактивной среды, промывают фосфатным буфером (рН 7) и ресуспендируют в этом ж& буфере.

Полученные радиоактивные клетки проверяют по трем параметрам. Во-первых,

определяется количество метки, поглощенной клетками. Определенное количество клеток гидролизуется. Радиоактивность гидролизата определяется на жидкостном сцинтилляционном счетчике. Во-вторых, оп.

ределяется соотнощение в ДНК и

РНК по методу Хатсфельда. Результаты определений показывают, что более 30% дезоксицитин- и более 60% тимидинмонофосфата обнаруживается в ДНК клетки. В-третьих, методом седиментации в градиенте СБ С1 определяют соотношение метки в ядерной и митохондриальной ДЫК. Результаты определений показывают, что подавляющее количество метки обнаруживается в ядерной ДНК. Подобным же способом, используя ауксотроф по аценину генотипа а adex, получают мутангы, поглощающне пуриновые предшественники ДНК. Таким образом, предлагаемый способ в результате использования мутации ауксотрофности по урацилу и аценину, позволяет получать мутанты дрожжей, способные эффективно и специфически поглошать экзогенные дезоксинуклеотиды в ядерную ДНК.

Пример 1. Двухсуточную культуру ау.ксотрофного по урацилу мутанта высевают па минимальную среду с 1 мМ УМФ. Концентрация клеток составляет 10 на чашку. 10 чашек с культурой облучают дозой УФ-лучей, вызывающей 90%-ную гибель клеток. После 7 дней инкубирования таких чашек в термостате при 30°С на каждой чашке появляется множество колоний мутантов дрожжей, способных усваивать экзогенный УМФ. Отбирают наиболее крупные колонии, клетки которых наиболее эффективно усваивают экзогенный УМФ, и поэтому обладают повышенной по сравнению с другими мутантами скоростью роста. Затем двухсуточную культуру отобранных мутантов вносят в минималБную жидкую среду, объемом 3 мл, с 0,25 мМ УМФ в конечной концентрации клеток, равной 10 на мл. Затем к суспензии добавляют 0,1 мКи/мл метил- Н-тимидинмонофосфаг (7 Ки/мМ) (выпускаемый Ленинградским отделением ВО «Изотоп). После 40 ч выращивания клетки отделяют от радиоактивной среды, четырежды промывают фосфатным буфером, ресуспендируют в 3 мл минимальной среды без глюкозы.

К 0,1 мл суспензии радиоактивных клеток прибавляют 0,2 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты, производят гидролиз ДНК при 30°С в течение 2 суток. После этого 0,1 мл гидролизата вносят в кювету с жидким сцинтиллятором и определяют число импульсов в мин на счетчике Nuclear Chicago. Обычно при эффективности счета 40% число «мпульсов на пробу составляет (2-5) . Ю.

Пример 2. Двухсуточную культуру ауксотрофного по адепину мутанта высевают на минимальную среду с 1,5 мМ АМФ. Концентрация клеток составляет 10 на чашку. 10 чашек с культурой облучают дозой УФ-лучей, вызывающей 90%-ную гибель клеток. После 7 дней инкубирования таких чашек в термостате при 30°С на каждой чашке появляется множество колоний мутантов дрожжей, способных усваивать из среды экзогенный АМФ. Отбирают наиболее крупные колонии. Затем двухсуточную культуру отобранных мутантов вносят в 3 мл минимальной жидкой среды с 1 мМ аденозинмонофосфата так, чтобы конечная концентрация клето-к достигла 10 на мл. Затем к суспензии добавляли 10-20 мк/Ки 8- Н-дезоксиаденозинмонофосфата с удельной активностью 10-14 Ки/мМ. (Препарат поставляется Ленинградским отделением ВО «Изотоп). После 40 ч выращивания клетки отделяли от радиоактивной среды, четырежды промывали фосфатным буфером (рН 70) и ресуспендировали в 3 мл минимальной среды без глюкозы; 0,1 мл полученной суспен. ЗИП (10 клеток) смешивали с 0,2 мл 10%ной трихлоруксусной кислоты и гидролизовали ДНК при 30°С. в течение 2 суток. Затем 0,1 мл гидролизата вносили в флаконы с жидким сцинтиллятором и определяли число импульсов в мин.

При эффективности счета 40% пробы обычно считают (2-5) 10 имп/мин.

Пример 3. Двухсуточную культуру аксотрофного по урацилу мутанта высевали на минимальную среду с 2,0 мМ УМФ. Концентрация клеток составляет 10 на чашку. После 7 дней инкубирования таких чашек в термостате при 30°С на каждой чашке появляются колонии спонтанно возникших мутантов дрожжей, способных усваивать экзогенный УМФ. Отбирают наиболее крупные колонии. Затем двухсуточную культуру отобранных мутантов вносили в 3 мл минимальной жидкой среды с 1 мМ УМФ так, чтобы конечная концентрация клеток достигала 10- на мл. Затем к суспензии добавляли 10-20 мк/Ки 5- Ндезоксицитидинмонофосфата с удельной активностью 15 Ки/мМ. (Препарат 5- НдЦМФ поставляет Ленинградское отделение ВО «Изотоп). После двух дней выращивания клетки отделяли от радиоактивной среды, четырежды промывали фосфатным буфером и ресуспендировали в 3 мл минимальной среды без глюкозы. 0,1 мл полученной суспензии (10 кл) смешивали с 0,2 мл 10%-ной трихлоруксусной кислоты и гидролизовали ДНК при 30°С в течение 2 суток. Затем 0,1 мл гндролизата вносили во флакон с жидким сцинтиллятором и определяли число импульсов в мин на жидкостном сцинтилляционном счетчике. При эффективности счета около 40% пробы обычно считали (2-4) .10 имп/мин.

Предлагаемый способ позволяет получать мутанты дрожжей, способные эффективно и специфично включать из среды роста в ядерную ДНК все четыре дезоксинуклеотида, и не требует дорогостоящих и

редких ингибиторов, не выпускаемых отечественной нромышленностыо.

Формула изобретения

Способ выделения мутантов дрожжей, поглощающих из среды и включающих в ДНК экзогенные нуклеотиды, предусматривающий использование селектирующего фактора, обработку мутагеном, высев микроорганизмов иа питательную среду, содержащую источник углерода, минеральные соли с добавлением нуклеотида, необходимого для отбора мутантов, снособных поглощать этот нуклеотид, выращивание известным способом с последующим отбором мутантов с целевыми свойства у1и, отличающийся тем, что, с целью выделения мутантов с расширенным спектром поглощения нуклеотидов и упрощения способа, в качестве селектирующего фактора используют мутации ауксотрофности по аденину н урацилу, концентрацию микроорганизмов берут клеток на чашку Петри, при

зтом из нуклеотидов добавляют уридинмонофосфат (УМФ) или аденозинмонофосфат (АМФ) в концентрации 1--2 мМ, а отбор мутантов проводят но величине выросших колоний мутантов с последующим культивированием их в жидкой нитательной среде, содержащей 0,25-2,0 мМ УМФ или АМФ.

Р1сточники информации,

принятые во внимание при экспертизе

1.М. Brendel,R. Н. Haynes «Exogenic timidine-S-mono phosphate as precuser for DNA synthesis in yeasto. Molec. gen. Genetik, V. 126, 337, 1973.

2.Глазер В. М., Лучник А. И. и Шевченко С. В. Специфичность включения радиоактивного дезоксиаденазина в митохондреальную ДНК у дрожжей Saccharomyces

cerevisiue. ДАН СССР, т. 241, 215, 1978.

3.R. В. Wiener «Mutanto of Saccharo. myces cerevisiae, which incorporate dioxytimidine S-nionophospate into DNA in vivo. L. Bacteriol, v. 117, № 1, 252, 1974.