МЕЧЕННЫЕ 125J ПРОИЗВОДНЫЕ ТИРОКСИНА В КАЧЕСТВЕ РЕАГЕНТА ДЛЯ РАДИОИММУННОГО АНАЛИЗА И ПРОИЗВОДНЫЕ ТИРОКСИНА В КАЧЕСТВЕ ПРОМЕЖУТОЧНЫХ СОЕДИНЕНИЙ ДЛЯ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ 125J ПРОИЗВОДНЫХ ТИРОКСИНА Советский патент 1994 года по МПК C07B59/00 C07D233/68 

Изобретение относится к меченым радионуклеидам - производным тироксина, конкретно к новым меченным ¹²⁵J производным тироксина общей формулы I HOOCHC где a) R₁= -NH(CH₂) ,
R₂ = -CH₃; б) R₁= OH, R₂= (CH₂) ; в) R₁= -NH(CH₂) R₂= (CH₂) в качестве реагента для радиоиммунного анализа, что позволяет использовать его в медицине, и к новым производным тироксина общей формулы II HOOCHC где
a)R₃= NH(CH₂) ,
R₄ = -CH₃;
б) R₃ = -OH,
R₄= (CH₂)OH ;
в)R₃= NH(CH₂) ;
R₄= (CH₂)OH в качестве промежуточных соединений для получения меченых ¹²⁵J производных тироксина.

Целью изобретения является выявление новых меченых ¹²⁵J производных тироксина в качестве реагентов для радиоиммуноанализа, способных связываться с антителами к тироксину, но не способных связываться с эндогенным тироксинсвязывающим белком.

П р и м е р 1. Получение N-ацетилтироксилгистамина (IIа).

Растворяют 50 г (54,4 мкмоль) N-оксисукцинимидного эфира N-ацетилтироксина в 2,5 мл диоксана и добавляют 12,8 мг (70,0 мкмоль) дигидрохлорида гистамина в 1,5 мл воды и 20,19 мкл (146,0 мкмоль) триэтиламина. Перемешивают в течение 20 ч при комнатной температуре (рН 8,5). Реакционную смесь упаривают, остаток растворяют в этилацетате и промывают водой, высушивают Na₂SO₄, упаривают. Получают 44 мг (87,0% ) аморфного N-ацетилтироксилгистамина (IIа). ИК-спектр ( ν, см^-1): 1550 (N - Н); 1645 (С= О). Мол. м. 912,0.

Найдено, % : С 29,01; Н 2,21; N 6,13; J 55,70; O - остальное.

Вычислено, % : С 28,95; Н 2,19; N 6,14.

П р и м е р 2. Получение N-ацетилтироксил-¹²⁵J-гистамина (Iа).

К раствору, содержащему 5 мкг (5,5 нмоль) N-ацетилтироксилгистамина (IIа) в 10 мкл 0,5 М фосфатного буфера добавляют 37 МБк (1 мКи) Na ¹²⁵J (без носителя) и 50 мкг хлорамина Т в 10 мкл воды. Реакцию останавливают через 60 с введением 300 мкг метабисульфита натрия в 10 мкл водного раствора. Реакционную смесь переносят на хроматографическую колонку, заполненную сорбентом. (Силосорб С 18 с размером частиц 7,5 мкм). Целевой продукт элюируют 50% -ным метиловым спиртом. Радиохимическая чистота продукта > 95% . Молярная активность 55-74 ПБк/моль (1500-2000 кКи/моль). Радиохимический выход 30% .

П р и м е р 3. Получение N-β-(n-оксифенил)пропионилтироксина (IIб).

Растворяют 50 мг (62,7 мкмоль) тироксина в 15 мл этилового спирта и добавляют 18,4 мг (70,0 мкмоль) N-оксисукцинимидного эфира β-(n-оксифенил)пропионовой кислоты и 0,1 мл N-метилморфолина. Перемешивают в течение 20 ч при комнатной температуре (рН 8,5). Реакционную смесь упаривают в вакууме, остаток растворяют в этилацетате, промывают 0,1 н. раствором соляной кислоты, водой, высушивают Na₂SO₄, упаривают в вакууме. Получают 50,0 мг (87,7% ) N- β-(n-оксифенил)пропионилтироксина (IIб), т. пл. 173-176^оС (этилацетат/гексан). ИК-спектр (ν , см^-1): 1520 (N - Н); 1640 (С= О); 1740 (С= О карбоксильной группы). Мол. м. 925,0.

Найдено, % : С 31,23; Н 2,09; N 1,47; J 55,49; О - остальное.

С₂₄Н₁₉O₆N₄
Вычислено, % : С 31,14; Н 2,05; N 1,51.

П р и м е р 4. Получение N-β-(¹²⁵J-n-оксифенил)пропионилтироксина (Iб).

К раствору, содержащему 5 мкг (5,4 нмоль) N-β-(n-оксифенил)пропионилтироксина (IIб) в 10 мл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,5), добавляют 37 МБк (1 мкКи) Na ¹²⁵J (без носителя) и 50 мкг хлорамина Т в 10 мкл воды. Реакцию останавливают через 60 с введением 300 мкг метабисульфита натрия в 10 мкл водного раствора. Реакционную смесь переносят на хроматографическую колонку (4х250 мм), заполненную сорбентом (Силосорб С 18 с размерами частиц 7,5 мкм). Целевой продукт элюируют 80% -ным метиловым спиртом. Радиохимическая чистота продукта > 95% . Молярная активность 55-74 ПБк/моль (1500-2000 кКи/моль). Радиохимический выход 35% .

П р и м е р 5. Получение N-β-(n-оксифенил)пропионилтироксилгистамина (IIв).

Растворяют 40 мг (43,2 мкмоль) N-β-(n-оксифенил)пропионилтироксина (IIб) в смеси 2 мл диоксана и 2 мл этилацетата и добавляют 5,8 мг (50,0 мкмоль) N-оксисукцинимида. Охлаждают до 1-2^оС и прикапывают раствор, содержащий 9,3 мг (45,0 мкмоль) дициклогексилкарбодиимида в 1,5 мл этилацетата. Перемешивают 1 ч при 1-2^оС и 20 ч при комнатной температуре. Выпавшую дициклогексилмочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме, остаток растворяют в 2,5 мл диоксана и добавляют 9,3 мг (50,0 мкмоль) дигидрохлорида гистамина в 1,5 мл воды и 14 мкл (100,0 мкмоль) триэтиламина. Перемешивают 20 ч при комнатной температуре (рН 8,5). Реакционную смесь упаривают до половины объема и экстрагируют этилацетатом. Органический слой промывают водой, высушивают Na₂SO₄, упаривают в вакууме. Получают 30 мг (63% ) N-β-(n-оксифенил)пропионилтироксилгистамина, т. пл. 163-166^оС (метиловый спирт/эфир). ИК-спектр (ν , см^-1): 1520 (N - H); 1650 (С= О). Мол. м. 1018,0.

Найдено, % : С 34,27; Н 2,58; N 5,40; J 50,12; О - остальное.

С₂₉Н₂₆О₅N₄J₄
Вычислено, % : С 34,18; Н 2,56; N 5,51.

П р и м е р 6. Получение N-β-(¹²⁵J n-оксифенил)пропионилтироксил-¹²⁵J-гистамина.

К раствору, содержащему 5 мкг (4,9 нмоль) N-β-(n-оксифенил)пропионилтироксилгистамина (IIв) в диметилформамиде (10 мкл), добавляюь 40 мкл 0,5 М фосфатного буфера (рН 7,8), 37 МБк (1мКи) Na ¹²⁵J (без носителя) и 50 мкг хлорамина Т в 10 мкл воды. Реакцию останавливают через 60 с введением 300 мкг метабисульфита натрия в 10 мкл водного раствора. Реакционную смесь переносят на хроматографическую колонку (4х250 мм), заполненную сорбентом (Силосорб С 18 с размерами частиц 7,5 мкм). Целевой продукт элюируют 60% -ным метиловым спиртом. Радиохимическая чистота продукта > 95% . Молекулярная активность 130-148 ПБк/моль (3730-4000 кКи/моль). Радиохимический выход 20% .

П р и м е р 7. Использование меченых производных тироксина (1a-1в) в радиоиммунном анализе.

Биологические свойства соединений Ia-Iв оценивают в радиоиммунологических системах, которые составляют из компонентов набора Т₄ - ПГ, предназначенного для радиоиммунного анализа (РИА) тироксина. Компонент набора - ¹²⁵J-тироксин (III) заменяют на меченые йодом-125 производные тироксина Ia-Iв.

На чертеже показаны калибровочные кривые РИА с использованием соединений III и Ia, Iб, Iв.

В табл. 1 приведены результаты проверки параметров РИА на соответствие техническим условиям.

П р и м е р 8. Изучают связывание меченых производных тироксина Ia-Iв и промежуточных соединений IIa-IIв с антителами к тироксину и с тироксинсвязывающим белком сыворотки крови человека. Для этого одинаковые количества меченых соединений Ia-Iв и ¹²⁵J-тироксина инкубируют при комнатной температуре в пробирках, содержащих анти-Т₄ - АТ, ТСГ (тироксинсвязывающий глобулин) или сыворотку до достижения равновесия между свободной и связанной с белками формами соединений (1-2 ч). Эти формы разделяют путем прибавления сепарирующего агента и центрифугирования. Рассчитывают долю связанной формы. Долю связанного [¹²⁵J] -тироксина принимают за 100% , доли связанных соединений Ia-Iв выражают относительно доли связанного [¹²⁵J] -тироксина ("относительное связывание").

Одинаковые количества промежуточных соединений Ia-Iв и тироксина инкубируют при комнатной температуре в пробирках, содержащих нековалентный комплекс [¹²⁵J] -тироксина с анти-Т₄ - АТ, ТСГ или сывороткой до достижения равновесия в этих системах (1-2 ч). Разделяют связанный и свободный (вытесненный из комплекса в результате связывания соединений IIa-IIв или тироксина) [¹²⁵J] -тироксин, относительную реакционную способность испытуемых соединений ("относительное связывание") определяют по отношению количеств тироксина и соединений Ia-Iв, вызывающих вытеснение половины количества тироксина из комплекса.

Результаты приведены в табл. 2.

Таким образом, меченые производные тироксина Ia-Iв связываются с антителами к тироксину, но не связываются в тироксинсвязывающим белком, что позволяет использовать их как для радиоиммуноанализа свободного тироксина, так и для радиоиммуноанализа общего тироксина (аналог может быть использован только для радиоиммуноанализа общего тироксина).

Изобретение касается радиоактивно меченных соединений, в частности ¹²⁵J -производных тироксина общей ф-лы I , где а) ; R₂- -CH₃ б) R₁- -OH; ; в) , , которые могут быть использованы как реагенты для радиоиммунного анализа. Цель изобретения - создание новых полупродуктов для синтеза ¹²⁵J меченных полупродуктов ф-лы I. Новые полупродукты общей ф-лы II , где а) ; R₄- -CH₃; б) R₃- -OH; R₄-(CH₂)₂-C₆H₄-OH; в) ; , получают реакцией, например, N-оксисукцинимидного эфира N-ацетилтироксина и дигидрохлорида гестамина в водно-диоксановой среде в присутствии триэтиламина. Синтез веществ ф-лы I из указанных полупродуктов ведут обработной ¹²⁵J в присутствии фосфатного буфера и хлорамина Т в среде воды с последующим элюированием 50% -ным метанолом. Радиохимический выход, % ; молярная активность, кКи/моль, радиохимическая чистота, % : а) 30; 1500 - 2000; >95; б) 35; 1500 - 2000; >95; в) 20; 3730 - 4000; >90. Новые вещества способны связываться с антителами к тироксину и не способны связываться с эндогенным тироксинсвязывающим белком. 2 с. п. ф-лы, 1 ил. , 2 табл.

Таким образом, меченые производные тироксина Ia-Iв связываются с антителами к тироксину, но не связываются в тироксинсвязывающим белком, что позволяет использовать их как для радиоиммуноанализа свободного тироксина, так и для радиоиммуноанализа общего тироксина (аналог может быть использован только для радиоиммуноанализа общего тироксина).

1. Меченные ¹²⁵J производные тироксина общей формулы
HOOCHC
где
a) R₁= -NH(CH₂)
б) R₁= OH, R₂= (CH₂)
в) R₁= -NH(CH₂)
R₂= (CH₂)
в качестве реагента для радиоиммунного анализа.

2. Производные тироксина общей формулы
HOOCHC
где
a)R₃= NH(CH₂) ,
R₄ = -CH₃;
б)R₃ = -OH, R₄= (CH₂)OH ;
в)R₃= NH(CH₂) ;
R₄= (CH₂)OH
в качестве промежуточных соединений для получения меченных ¹²⁵J производных тироксина.