СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРАТНОМЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ ПРОСТАГЛАНДИНОВ ТИПА E ИЛИ ИХ ПРОИЗВОДНЫХ ТИПА A, B, F, ИЛИ МЕТИЛОВЫХ ЭФИРОВ ПРОСТАГЛАНДИНОВ ТИПА J Советский патент 1994 года по МПК C07B59/00 C12P31/00 

Изобретение относится к методу биосинтеза кратномеченных тритием простагландинов Е₁, Е₂, Е₃ или их производных, которые могут найти применение в медицине, например, при лечении сердечно-сосудистой системы.

Цель изобретения - повышение выхода и расширение ассортимента меченных тритием простагландинов.

Сущность изобретения иллюстрируется следующими примерами.

П р и м е р 1. Получение [³H] ПГЕ₂.

а) Получение ПГН-ПГЕ-изомеразы.

120 г везикулярных желез барана в 250 мл 50 ммоль трис-НСl буфера (рН 8), содержащего 0,5 ммоль EDTA, 0,5 ммоль восстановленного глутатиона, 0,05 ммоль дитиотрейтола, 20% этиленгликоля (буфер А), охлажденного до 4^оС, гомогенизируют в Waring Comm. Вlender (8 раз х 0,5 мин) и центрифугируют 15 мин при 12˙10³ g. Супернатант (250 мл) фильтруют через четыре слоя марли и центрифигуруют 90 мин при 100˙10³ g. Осадок гомогенизируют в 220 мл буфера А и центрифугируют 90 мин при 100˙10³ g. Осадок (микросомальная фракция) ресуспендируют в 50 мл буфера А и солюбилизируют мембранные белки добавлением 5 мл 10% Tween 20. Смесь выдерживают 30 мин при 4^оС и затем центрифугируют 90 мин при 100˙10³ g. 30 мл солюбилизированного ферментного препарата наносят на колонку (2,5х30,0 см) с DEAE-целлюлозой, предварительно уравновешенной 10 ммоль калийфосфатным буфером, содержащим 0,1% Tween 20 и 5 ммоль восстановленного глутатиона (буфер Б). Колонку промывают 200 мл буфера Б. ПГН-ПГЕ-изомеразная активность элюируется 200 ммоль калийфосфатным буфером, содержащим 0,05% Tween 20 и 5 ммоль восстановленного глутатиона. Скорость элюции 50-60 мл˙ч^-1.

ПГН-ПГЕ-изомеразная активность в полученном препарате фермента (25 мл, концентрация белка 4 мг˙мл^-1) равна 0,6 мкмоль ПГЕ₂ за 30 мин на 1 мл ферментного препарата (32^оС, рН 7,4).

б) Получение ПГН-синтетазы.

Для получения солюбилизированного препарата ПГН-синтетазы используют методику, идентичную методике получения солюбилизированного препарата для выделения ПНГ-ПГЕ-изомеразы, но с использованием вместо буфера А 50 ммоль трис-НСl буфера, рН 8, содержащего 0,5 ммоль EDTA, 0,1 ммоль диэтилдитиокарбамата, 0,1% неионного детергента Lubrol PX. Из 150 г везикулярных желез барана получают 63 мл солюбилизированного ферментного препарата, который наносят на колонку (2,5х30 см) и DEAE-целлюлозой, предварительно уравновешенной 20 ммоль калий-фосфатным буфером, рН 7,4, содержащим 0,5 ммоль ЕDTA, 0,1 ммоль дитилдитиокарбамата и 0,05% Lubrol. РХ ПГН-синтетазная активность элюируется этим же буфером.

Получают 90 мл ферментного препарата (концентрация белка 0,9 мг˙мл^-1 с активностью 7,5 мкмоль арахидоновой кислоты х х мин^-1 мл^-1)25^оС, рН 8).

в) Получение [³H] ПГЕ₂.

К раствору 1,4 ГБк [5, 6, 8, 9, 11, 12, 14, 15 -³H₈] арахидоновой кислоты с молярной активностью 7,03 ПБк/моль в 40 мкл этилового спирта добавляют 970 мкл воды, 26 мкл 200 мкМ раствора гемина и 16,4 мкл 100 мМ раствора восстановленного глутатиона. Прединкубируют реакционную смесь 5 мин при 23^оС и добавляют предварительно проинкубированную при 23^оС смесь 39 мкл препарата ПГН - синтетазы и 195 мкл ПГН-ПГЕ-изомеразы (соотношение ПГН-синтетазной и ПГН-ПГЕ-изомеразной активностей 0,4; количество арахидоновой кислоты, 0,68 мкмоль на единицу активности ПГН-синтетазы).

Выдерживают инкубационную смесь 5 ч при 23^оС, затем добавляют 2М раствор лимонной кислоты до рН 3 и экстрагируют этилацетатом (5х20 мл). При этом в экстракте оказывается 90% всей радиоактивности. Экстракт сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют, упаривают и растворяют в 5 мл метанола. Выход [³H] -ПГЕ₂ определяют с помощью ТСХ продуктов реакции на палстинках Силуфол (ЧССР) в системе растворителей хлороформ - метанол-уксусная кислота (90: 9: 1) (система А). Распределение радиоактивности на пластинке определяют сканированием, выход [³H] -ПГЕ₂83% . При температуре инкубации 40^оС выход [³H] -ПГЕ₂ 75% , при 10^оС 53% . Увеличение соотношения активностей ПГН синтетазы и ПГН-ПГЕ-изомеразы свыше 0,4 не влияет на выход целевого продукта, а уменьшение его ниже 0,064 приводит к снижению выхода. Очистку [³H] -ПГЕ₂ осуществляют методом ВЭЖХ следующим образом: метанольный раствор продуктов синтеза упаривают, остаток растворяют в 150 мкл метанола, фильтруют через патрон в с обращенной фазой Servachrom si 100 Polyol 30 мкм - RP18 -("Serva"), промывают 2 раза 150 мкл метанола, упаривают, растворяют в 100 мкл 20% -ного раствора ацетонитрила в воде, содержащего 0,1% уксусной кислоты, и наносят на колонку (Separon 5 С 18; 3,3х150 мм; ЧССР). Элюцию проводят 33% -ным раствором ацетонитрила в воде, содержащим 0,1% уксусной кислоты, со скоростью 0,5 мл/мин.

Получают 1,16 ГБк [³H] -ПГЕ₂ с молярной радиоактивностью 5,6 ПБк/моль и радиохимической чистотой 97% .

П р и м е р 2. Получение [³H] ПГЕ₁.

По методике, аналогичной методике, описанной в примере 1, получают 1,14 ГБк [³H] ПГЕ₁ с полярной радиоактивностью 4,4 ТБк/ммоль из 1,4 ГБк [³H] дигомо-γ-линоленовой кислоты (молярная радиоактивность 5,6 ТБк/ммоль). Выход 82% , радиохимическая чистота 97% .

П р и м е р 3. Получение [³H] ПГF_1α и [³H] ПГF_1β. [³H] ПГF_2α и [³H] ПГF_2β.

К 20 мкг [³H] ПГЕ (0,24 ГБк [³H] ПГЕ₁, молярная радиоактивность 4,4 ПБк/моль или 0,31 ГБк [³H] ПГЕ₂, молярная радиоактивность 5,6 ПБк/моль) добавляют 2,5 мкг боргидрида натрия (25% избыток) в 0,3 мл метанола и выдерживают 5-7 мин при комнатной температуре. Затем реакционную смесь подкисляют 1 н. НСl до рН 3, упаривают метанол, разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Органические фазы объединяют, промывают водой (1 млх2), упаривают, растворяют в 0,1 мл метанола и очищают с помощью ТСХ в системе А на силикагельных пластинках фирмы Merck [³H] . ПГF_α и [³H] ПГF_β идентифицируют, сопоставляя их хроматографическую подвижность с хроматографической подвижностью стандартов (см. таблицу). Зоны, содержащие ПГF_α и ПГF_β , вырезают, экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Получают [³H] ПГF _1α с выходом 33% и [3H] ПГF _1β с выходом 38% (молярная радиоактивность обоих препаратов 4,2 ТБк/ммоль); ПГF _2α с выходом 35% и ПГF _2β с выходом 39% (молярная радиоактивность обоих препаратов 5,2 ТБк/ммоль). Радиохимическая чистота ПГF_α и ПГF_β 95-97% .

П р и м е р 4. Получение [³H] ПГА₁ и [³H] ПГА₂.

23 мкг [³H] ПГЕ (0,28 ГБк [³H] ПГЕ₁, молярная радиоактивность 4,4 ТБк/ммоль или 0,35 ГБк [³H] ПГЕ₂, молярная радиоактивность 5,6 ТБк/ммоль) растворяют в 0,3 мл диоксана, добавляют 2 мкл 1 н. НСl и выдерживают реакционную смесь 4 ч при 30^оС или 1 ч при 50^оС. Затем реакционную смесь несколько раз упаривают с метанолом до полного удаления соляной кислоты, растворяют остаток в 0,1 мл метанола и очищают с помощью ТСХ в системе А на силикагельных пластинках фирмы Merck. [³H] ПГА идентифицируют, сопоставляя их хроматографическую подвижность с хроматографической подвижностью стандартов (см. таблицу). Зону, содержащую [³H] ПГА, вырезают и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Получают [³H] ПГА₁ с выходом 73% и молярной радиоактивностью 3,35 ТБк/ммоль. [³H] ПГА₂ с выходом 73% и молярной радиоактивностью 4,2 ТБк/ммоль. Радиохимическая чистота препаратов 95-97% .

П р и м е р 5. Получение [³Н] ПГВ₁ и [³H] ПГВ₂.

8 мкг [³H] ПГЕ (0,1 ГБк [³H] ПГЕ₁, молярная радиоактивность 4,4 ПБк/моль или 0,12 ГБк [³H] ПГЕ₂, молярная радиоактивность 5,6 ПБк/моль) pаствоpяют в 0,3 мл этилового спирта, добавляют 2 мкл 8 н. КОН и выдерживают 10 мин при 35^оС. Затем раствор подкисляют 1 н. уксусной кислотой до рН 3, упаривают несколько раз с метанолом, растворяют остаток в 2 мл этилацетата, промывают водой, упаривают этилацетат досуха, остаток растворяют в 0,1 мл метанола и очищают с помощью ТСХ в системе А на силикагельных пластинках фирмы Merck. [³H] ПГВ идентифицируют, сопоставляя их хроматографическую подвижность с хроматографической подвижностью стандартов. Зону, содержащую [³H] ПГВ, вырезают и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Получают [³H] ПГВ₁ c выходом 80% и молярной радиоактивностью 3,9 ТБк/ммоль. Радиохимическая чистота препаратов 95-97% .

П р и м е р 6. Получение МЭ ПГI₂.

18 мкг (0,25 ГБк) [³H] ПГF _2α с молярной радиоактивностью 5,2 ТБк/ммоль растворяют в 1 мл эфира и обрабатывают эфирным раствором диазометана (трехкратным избытком). Через 5 мин эфир упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 1 мл эфира и при 0^оС обрабатывают смесью 0,2 мл насыщенного водного раствора бикарбоната натрия и 0,1 мл 2,5% -ного раствора иона в эфире. Реакционную смесь перемешивают 12 ч при 0^оС, после чего добавляют 5% -ный водный раствор тиосульфата натрия до исчезновения окраски, а затем 1 мл воды и 2 мл этилацетата. Органический слой отделяют, промывают водой (2 млх3), упаривают и очищают методом ТСХ на силикагельных пластинках (Merck) в системе растворителей хлороформ-ацетон (2: 1) (система Б). Зону, содержащую МЭ [³H] I-эфира ПГI₁, вырезают и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Органический растворитель упаривают, остаток обрабатывают 0,5 мг 1,8-диазобицикло (5,4,0) ундец-7-уна в 0,2 мл абс. бензола (3 ч, 110^оС, запаянная ампула). Затем содержимое ампулы охлаждают до комнатной температуры и обрабатывают 1 мл 0,1 н. водного раствора едкого натра. Органическую фазу отделяют, растворитель упаривают, продукт очищают методом ТСХ на пластинках Силуфол (ЧССР) в системе Б. Зону, содержащую меченый препарат, вырезают и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Выход МЭ [³H] ПГI₂ 43% , молярная радиоактивность 4,5 ТБк/ммоль, радиохимическая чистота 97% .

П р и м е р 7. Получение [³H] -ПГЕ₃.

К раствору 2,3 ГБк (0,25 мкмоль) [5, 6, 8, 9, 11, 14, 15, 17, 18 - ³H₁₀] -тимнодоновой кислоты с молярной радиоактивностью 9,25 ПБк/моль в 150 мкл этилового спирта добавляют 3,63 мл воды, 250 мкл 200 мМ К-фосфатного буфера, содержащего 0,05 lubrol PX, 100 мкл 100 мМ раствора адреналина, 50 мкл 200 мкМ раствора гемина, 88 мкл 100 мМ раствора восстановленного глутатиона. Прединкубируют реакционную смесь 5 мин при 23^оС и добавляют предварительно проинкубированную при 23^оС смесь 500 мкл препарата ПГН-синтетазы и 250 мкл ПГН-ПГН-изомеразы (соотношение ПГН-синтетазной и ПГН-ПГЕ-изомеразной активностей 0,04; количество тимнодоновой кислоты 0,067 мкмоль на единицу активности ПГН-синтетазы).

Выдерживают инкубационную смесь 5 ч при 23^оС, затем добавляют 86 мкл 2 М раствора лимонной кислоты и экстрагируют этилацетатом (5х20 мл). При этом в экстракте оказывается 90% всей радиоактивности. Экстракт сушат безводным сульфатом натрия, фильтруют, упаривают и растворяют в 5 мл метанола. Выход [³H] -ПГE₃ определяют с помощью ТСХ продуктов реакции в системе А. Распределение радиоактивности по пластинке определяют с помощью сканирования.

Выход [³H] -ПГЕ₃ равен 47-53% . Снижение соотношения активностей ПГН-синтетазы и ПГН-ПГЕ-изомеразы ниже 0,064 или увеличение соотношения свыше 0,4 также приводит к образованию целевого продукта. При температуре инкубации 32^оС выход [³H] ПГЕ₃ - 40% . Очистку [³H] -ПГЕ₃осуществляют методом ВЭЖХ аналогично примеру 1.

Получают 0,93 ГБк [³H] -ПГЕ₃ с молярной радиоактивностью 7,4 ПБК/моль.

П р и м е р 8. Получение [³H] -ПГЕ₃. 23 мкг (0,48 ГБк) [³H] -ПГЕ₃c молярной радиоактивностью 7,4 ПБк/моль растворяют в 0,3 мл диоксана, добавляют 2 мкл 1 н. НСl и выдерживают реакционную смесь 4 ч при 30^оС или 1 ч при 50^оС. Затем реакционную смесь несколько раз упаривают с метанолом до полного удаления соляной кислоты, растворяют остаток в 0,1 мл метанола и очищают с помощью ТСХ с системе А на силикагельных пластинках фирмы Merck. [³H] ПГА₃ идентифицируют, сопоставляя его хроматографическую подвижность с хроматографической подвижностью стандарта. Зону, содержащую [³H] ПГА₃, вырезают и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Получают [³H] ПГА₃ с выходом 73% и молярной радиоактивностью 5,8 ПБк/моль. Радиохимическая чистота препарата 95-97% .

П р и м е р 9. Получение [³H] ПГВ₃. 8 мкГ (0,17 ГБк) [³H] ПГЕ₃ c молярной радиоактивностью 7,4 ПБк/моль растворяют в 0,3 мл этилового спирта, добавляют 2 мкл 8 н. КОН и выдерживают 10 мин при 35^оС. Затем раствор подкисляют 1 н. уксусной кислотой до рН 2, упаривают несколько раз с метанолом, растворяют остаток в 2 мл этилацетата, промывают водой, упаривают этилацетат досуха, остаток растворяют в 0,1 мл метанола и очищают с помощью ТСХ в системе А на силикагельных пластинках фирмы Merck. [³H] ПГВ₃ идентифицируют, сопоставляя его хроматографическую подвижность с хроматографической подвижностью стандарта. Зону, содержащую [³H] ПГВ₃, вырезают и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Получают [³H] ПГВ₃ с выходом 77% и полярной радиоактивностью 5,2 ПБк/моль. Радиохимическая чистота препарата 95-97% .

П р и м е р 10. Получение [³H] -ПГF _3α и [³H] -ПГF _3β .

К 20 мкГ (0,42 ГБк) [³H] -ПГЕ₃ с молярной радиоактивностью 7,4 ПБк/моль добавляют 2,5 мкг боргидрида натрия (25% -ный избыток) в 0,3 мл метанола и выдерживают 5-7 мин при комнатной температуре. Затем реакционную смесь подкисляют 1 н. НСl до рН 3, упаривают метанол, разбавляют водой и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Органические фазы объединяют, промывают водой (1 млх2), упаривают, растворяют в 0,1 мл метанола и очищают с помощью ТСХ в системе А на силикагельных палстинках фирмы Merck. [³H] ПГF _3α и [³H] ПГF _3β идентифицируют, сопоставляя их хроматографическую подвижность с хроматографической подвижностью стандартов. Зоны, содержащие [³H] ПГF _3α и [³H] ПГF _3β , вырезают, экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Получают [3H] ПГF _3α с выходом 34% и [³H] ПГF _3β с выходом 39% . Молярная радиоактивность обоих препаратов 7,3 ПБк/моль, радиохимическая чистота 95-97% .

П р и м е р 11. Превращение [³H] ПГF _3α в метиловый эфир [³H] простациклина серии 3 (МЭ [³H] ПГI₂).

18 мкг (0,37 ГБк) [³H] ПГF _3α растворяют в 1 мл эфира и обрабатывают эфирным раствором диазометана (трехкратным избытком). Через 5 мин эфир упаривают при пониженном давлении, остаток растворяют в 1 мл эфира и при 0^оС обрабатывают смесью 0,2 мл насыщенного водного бикарбоната натрия и 0,1 мл 2,5% -ного раствора иода в эфире. После 12 ч перемешивания реакционной смеси при 0^оС добавляют 5% -ный водный раствор тиосульфата натрия до исчезновения окраски. Затем добавляют 1 мл воды и 2 мл этилацетата. Органический слой промывают водой (2 млх3), упаривают и очищают методом ТСХ на силикагельных пластинках (Merck) в системе Б. Зону, содержащую МЭ [³H] I-эфира ПГI₁, вырезают и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Органический растворитель упаривают, остаток обрабатывают 0,5 мг 1,8-диазобицикло (5, 4, 0)ундец-7-ена в 0,2 мл абс. бензола (3 ч, 110^оС, запаянная ампула). Затем содержимое ампулы охлаждают до комнатной температуры и обрабатывают 1 мл 0,1 н. водного раствора едкого натра. Органическую фазу отделяют, растворитель упаривают, продукт очищают методом ТСХ на пластинках Силуфол (ЧССР) в системе Б. Зону, содержащую меченый препарат, вырезают и экстрагируют этилацетатом (1 млх3). Выход МЭ [³H] -ПГF₂ МЭ ПГI₃ - 43% , малярная радиоактивность 6 ТБк/ммоль, радиохимическая чистота 97% .

Хроматографическая подвижность меченых препаратов, которая полностью совпадает с хроматографической подвижностью соответствующих стандартов, приведена в таблице.

Реализация описываемого способа за счет применения очищенных препаратов ПГН-синтетазы и ПГН-ПГЕ-изомеразы и более низкой температуры инкубации (23^оС) позволяет повысить выход ПГЕ₂ с 46% в известном способе до 83% и получить ряд новых кратномеченых тритием простагландинов. (56) Шевченко В. П. , Нагаев И. Ю. и др. Получение кратномеченных полиненасыщенных жирных кислот селективным восстановлением из ацетиленовых производных газообразным тритием. - Радиохимия, 1986, с. 28, N 1, с. 67-72.

Изобретение касается простагландинов, в частности способа получения кратномеченных тритием простагландинов типа Е серии E₃ или E₁ E₂, или их производных типа A, B, F, или метиловых эфиров простагландинов типа 1, которые могут найти применение в медицине, например при лечении сердечно-сосудистой системы. Цель - повышение выхода и расширение ассортимента целевых соединений. Процесс ведут инкубацией фермента с соответствующими мечеными полиеновыми кислотами при 10 - 40С (лучше при 23С) с выделением соответствующего простагландина серии Е. В качестве фермента используют смесь отдельно выделенных из везикулярных желез барана ПГН-синтетазы и ПГН-НГЕ-изомеразы, взятых в отношении 0,064 - 0,4 единиц активности ПГН-НГЕ-изомеразы на единицу активности ПГН-синтетазы. Эту смесь добавляют к смеси кратномеченной тритием соответствующей кислоты - дигомо-линолевой или арахидоновой или тимнодоновой, взятой в отношении 0,2 - 1,35 мкмоль на единицу активности ПГН-синтетазы, этанола, воды, раствора адреналина, гемина и восстановленного глутатиона. Инкубацию проводят при 10 - 40С с выделением соответствующего простагландина типа Е. Последний при необходимости, изомеризуют в присутствии кислоты в простагландин типа А, или в простагландин типа F обработкой боргидридом натрия. В случае получения простагландина типа F_α его, при необходимости превращают в метиловые эфиры простагландинов типа I последовательной обработкой диазометаном, иодом и 1,8-диазобицикло-(5, 4, 0)-ундец-7-еном. Эти условия повышают выход простагландинов типа F_α с 46 до 83% и обеспечивают получение ряда новых кратномеченных тритием простагландинов. 1 табл.

Способ получения кратномеченных тритием простагландинов типа E первой или второй, или третьей серий или их производных типа A, B, F, или метиловых эфиров простагландинов типа I путем инкубации фермента с соответствующими мечеными полиеновыми кислотами, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода и расширения ассортимента простагландинов, в качестве фермента используют смесь отдельно выделенных из везикулярных желез барана ПГН-синтетазы и ПГН - ПГЕ-изомеразы, взятых в отношении 0,064 - 0,4 единиц активности ПГН - ПГЕ-изомеразы на единицу активности ПГН-синтетазы, которую добавляют к смеси кратномеченной тритием соответствующей кислоты дигомо- γ -линоленовой или арахидоновой или тимнодоновой, взятой в отношении 0,2 - 1,35 мкмоль на единицу активности ПГН-синтетазы, этанола, воды, раствора адреналина, гемина и восстановленного глутатиона, и инкубацию проводят при 10 - 40^oС с выделением соответствующего простагландина типа E, который при необходимости превращают в простагландин типа A кислотной изомеризацией, или в простагландин типа В щелочной изомеризацией, или в простагландин типа F обработкой боргидридом натрия и в случая получения простагландина типа F_α его при необходимости превращают в метиловые эфиры простагландинов типа I последовательной обработкой диазометаном, иодом и 1,8-диазобицикло (5,4,0)ундец-7-еном.