Способ получения внеклеточной инвертазы из дрожжей Советский патент 1993 года по МПК C12N9/26 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в микробиологической промышленности, а кондитерской промышленности для приготовления некристаллизуемых начинок, в производстве безалкогольных напитков и кзк биохимический препарат.

Цель изобретения - повышение выхода целевого продукта.

Способ заключается в том, что дрожжи культивируют на среде, содержащей источники углерода и азота, до начала логарифмической фазы роста,проводят обработки в баллистическом дезинтеграторе в рециркуляционном рехшме. продолжают культивирование до конца логарифмической фазы роста, повторяют дезинтеграцию и культивируют дрожжи до максимального накопления инвертазы в среде.

Обработка культуральной жидкости в баллистическом дезинтеграторе в рецирку ЛЯЦ1ЛОННОМ режиме не приводит к нарушению {или временной остановке) процесса культивирования. В момент дезинтеграц /1и происходит разрушение части клеток не более 15-20 мас.%, которые через 2-3 ч культивирования не обнаруживаются. Содержимое разрушенных клеток выходит в среду, за счет чего, вероятно, может интенсифицироваться как рост культуры, так и синтез ферментов, в том числе и инвертазы. Остальные клетки в популяции сохраняют свою жизнеспособность, чем и оОьясняется отсутствие нарушения роста культуры. Однако, как показывает электронная микроскопия, клеточная стенка этих клеток видоизменяется, что, по-видимому, и обуславливает нарушение связи иивертазы с клеткой и выход основной ее массы в среду в процессе дальнейшего культивирования. Если в момент дезинтеграции разрушается более 20% клеток процесс проходит также с выходом инвертазы в среду, но увеличивается его длительность. Обработка культуральной жидкости о баллистическом дезинтеграторе может быть проведена и в другие моменты логарифмической фазы роста культуры, но осуществление ее предлагаемым способом (в начале и е конце лоКорифмической фазы роста) обеспечивает наилучшие результаты как по выходу инвертазы, так и по длительности процесса. Проведение дезинтеграции во время стационарной фазы нецелесообразно, так как не приводит к дальнейшему увеличению содержания инвертазы в среде (см. чертеж). П р м м е р 1. Дрожжи Saccharomyces cerevH,lae Т-32 выращивают в 10-литровом ферментере (АК-10) с 5 л среды, содержащей г/л: пегпон 20. сахароза (TexH.)30.jB

качестве инокулята используют 2-суточную культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации: 80%. насыщения 02; 800 об/мин; рН 5,8. В процессе ферментации в начале логарифмической фазы роста дрожжей проводят обработку всего содержимого ферментера в баллистическом дезинтеграторе ФУГ-1 в течение 2 мин. Дезинтеграцию (обработку) проводят в импульсно-рециркуляционном режиме D течение 2 мин, скорость вращения ротора 1500 об/мин; абразивный материал - дивинилбензолстирол (микрошзрики дма- метром 200-300 мкм) в количестве 100 мл насыпного объема. Получающийся при этом нативный дезинтеграт с процентом разрушенных клеток не более 15-20 мас.% от общей биомассы подают в ферментер. Через 2-3 ч роста в ферментере не обнаружи- вают разрушенных клеток.

Накопление секретируемой инвертэзы после обработки с помощью баллистического дезинтегратора ФУГ-1 резко увеличивается в среде роста (см.чертеж). 5 3 конце логарифмической фазы роста вышеописанную процедуру повторяют, Процесс культивирования продолжают до наступления стационарной фазы роста (40 ч). Максимальная активность инвертэзы в 0 среде к этому моменту составляет 26,5 Е/мл, удельная активность 13,2 Е/мг белка. Контроль. Осуществляют, как описано в примере, но культивирование проводят по известному способу, т.е. без обработки 5 культуральной жидкости в процессе культивирования в баллистическом дезинтеграторе в рециркуляционном ремсиме. Максимальная активность инвертазы в среде составляет 4,6 Е/мл. Большая часть ик- 0 вертазы остается связанной с клеткой (37,4 Е/мл), для ее извлечения необходимо разрушение клеток, при этом удельная активность в получаемом дезиитегрэте составляет 2,05 Е/мг бепка. 45 П р и м е р 2. Способ осуществляют, как описано в примере 1, но в качестве продуцента используют д рожжи Saccharomyces cerevis aeD-15 (303-67 АТСС 26524). Процесс культивирования продоя- 50 жают до наступления стационарной фазы роста (30 ч). Максимальная активность иивертазы в среде к этому моменту 3,6 Е/мл, удельная активность 4,7 Е/мг белка.

Примерз. Способ осуществляют, как 55 описано о примере 1. но в качестве штамма- продуцентра используют Saccharomyces terres trls D-28, который выращивают в 100- литровом ферментере с 70 л среды, содержащей, г/л; пептон 20, сахароза (техн.) 20. В качестве инокупята используют суточную

культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации: 80--90% насыщения Ог; 800 об/мин; рН 5,6. Максимальная активность инвертазы в момент выхода культуры в стационарную фазу роста (37 ч) составляет 9,2 Е/мл; удельная активность 9,8 Е/мг белка.

П р и м е р 4. Способ осуществляют, как описано в примере 1, но в качестве продуцента используют Saccharomycess carlsbergensls 48-16 ССУ, которые выращивают D 100-литровом ферментере с 70 л среды, содержащей, г/л: пептон 20, сахароза (техн.) 20. В качестве инокулпта используют 2-суточную культуру, выращенную в колбах на той же среде. Режим ферментации: 80- 85% насыщения Оа: 780 об/мин; рН 5,7. Максимальная активность инвертазы в момент выхода в стационарную фазу роста ( 12 ч) составляет 16,8 Е/мл; удельная актив- ность 18,2 Е/мг белка.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет увеличить выход фермента в среду, сократить продолжительность процесса культивирования с 72 до Q ч, т.е. в 1,8 раза.

Препарат иноертазы, полученный предлагаемым способом (удельная активность

13,2 Е/мг белка), содержит знзчителы с меньше посторонних белков и примесей других веществ в отличие от препаратов, получаемых выделением инвертазы непосредственно из клеток после их разрушения (2.05 Е/мг белка), что дает осиосание упростить процесс очистки фериентл.

Так как в предлагаемом способе используют хлебопекарные дрожжи, а пнпертаза накапливается в среде и для ее выделения не требуется разрушать биомяссу. то возникают предпосылки для рассмотрения вопроса об использовании биомассы, остающейся после отделения жидкой фазы, содержащей внеклеточные ферменты, для пищевых целей или для выделения ценных внутриклеточных компонентов.

(56) Патент США N; 3887434, кл. С 12 D 13/10, 1975.

Tslomenko А.В., Lupasfiln V.V., Kulaev I.S. Export of enzymes In culture medium by jeast of Saccharomyces genus. In.: International sympozlum of extraceliular enzymes of microorganisms. Bechine castle. Czech, Abstracts, 1986, p,41-42.

Изобретение позволяет получать фермент из фильтрата культуральной жидкости пекарских дрожжей. С целью повышения выхода целевого продукта в среду культивирования в процессе выращивания дрожжей в начале и в конце логариф- fAwecKoR фазы роаа проводят обработку культу- рапьной жцдкэаи в баллистическом дезинтеграторе в рециркуляционном режиме до аепени разрушения клеток не более 15-20 мас.%. 1 ид

Формулаизобретения30

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ВНЕКЛЕТОЧНОЙ ИНВЕРТАЗЫ ИЗ ДРОЖЖЕЙ, включающий культивирование продуцирующего микроорганизма на питательной среде, со- ,.jg держащей источники углерода, азота и воду, до максимального накопления

инвертазы, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, в процессе культивирования в нача ле и в конце логарифмической фазы роста культуральную жидкость обрабатывают в баллистическом дезинтеграторе в рециркуляционном режиме до достижения степени

i разрушения клеток не более 15-20 мас.%.

- 1пкт яея/iyefiHfai .;

: о-сэ -permтитнвйкуяипу и . / - .

(mt8itota lnett/temovteuuH8efmei. и KOHtnpoiHHOH eofutt mt .:

С - aнmu8н(ffn SHfKffffttOVifa unStfieeiit .rS eavntneM(iafUtt ir№,

;,. } -Sfffenuf fffiUHfftftpstaa.

Wtm.w