СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОСОМАЛЬНОЙ ФРАКЦИИ АЛКАНОКИСЛЯЮЩИХ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA MALTOSA Российский патент 1995 года по МПК C12N1/00 

Изобретение относится к биотехнологии и касается технологии получения ферментных препаратов, более конкретно получения ферментных препаратов из алканокисляющих дрожжей Candida maltosa.

Известно, что микросомальная фракция клеток является местом локализации определенных групп ферментов, в частности ферментов, осуществляющих окислительную трансформацию различных веществ. По этой причине выделенные из микробных клеток микросомы являются богатым источником ферментов. Эта фракция практически может использоваться как полиферментный препарат или служить источником получения индивидуальных ферментов. В полной мере все сказанное относится к случаю настоящего изобретения.

Алканокисляющие дрожжи Candida maltosa содержат в микросомах большой ассортимент ферментов, в частности, цитохромы, алкогольоксидазы и др. В этой связи практически все методы выделения подобных ферментов из этих дрожжей фактически предусматривают этап предваритель- ного выделения из клеток микросомальной фракции.

Принципиально известный способ получения микросомальной фракции заключается в том, что питательную среду на основе алканов засевают посевным дрожжевым материалом, инкубируют в течение необходимого времени, отделяют биомассу, разрушают ее и выделяют целевой продукт.

В большинстве случаев питательная среда содержит в качестве единственного источника углерода и энергии смесь алканов, содержащую преимущественно н-алканы.

Наиболее близким к предложенному по технической сущности можно признать способ получения микросомальной фракции алканокисляющих дрожжей Candida maltosa, заключающийся в том, что посевную дрожжевую культуру в конечной концентрации 0,05-0,1 кг/мл среды вносят в ферментационную питательную среду, содержащую в качестве единственного источника углерода и энергии смесь алканов, культивируют до середины экспоненциальной фазы роста, отделяют биомассу, разрушают ее и выделяют целевой продукт дифференциальным центрифугированием.

Недостатком известного способа является то, что выделенная микросомальная фракция обладает сравнительно низкой ферментативной активностью как суммарной, так и удельной.

Недостатки способа-прототипа не устраняются и при выделении микросомальной фракции осаждением полиэтиленгликолем, солями кальция и другими методами.

Цель изобретения повышение ферментативной активности микросомальной фракции используемых алканокисляющих дрожжей.

Цель была достигнута в результате того, что посевной материал вносили до конечной концентрации в ферментационной среде не менее 1,5 г/л, в качестве единственного источника углерода и энергии использовали н-декан, а культивирование осуществляли до стационарной фазы роста культуры.

Существо предложенного способа заключается в следующем.

Предварительно на основе косяков коллекционной культуры готовят посевной материал с высокой концентрацией клеток. Этим посевным материалом засевают ферментационную среду до конечной концентрации в ней клеток на уровне не менее 1,3 г/л. Оптимальная концентрация клеток составляет 1,5 г/л и дальнейшее ее повышение не дает каких-либо преимуществ.

Ферментационная среда содержит в качестве единственного источника углерода и энергии индивидуальный н-декан. Она дополняется минеральными солями и витаминами, обычно применяющимися при культивировании этого вида алканокисляющих дрожжей.

Для получения микросомольной фракции с высокой ферментативной активностью могут быть использованы различные штаммы Candida maltosa.

Культивирование осуществляют до перехода культуры в стационарную фазу роста, что достигается обычно при соблюдении всех условий на 23-25 ч выращивания.

Отделение биомассы осуществляют традиционными методами, преимущественно центрифугированием.

Для разрушения биомассы пригодны любые общепринятые методы, но процесс необходимо проводить при пониженной температуре, оптимально при температуре не выше 4^о. Важно, чтобы в процессе разрушения не создавалось локальных зон с более высокой температурой, поскольку большинство микросомальных ферментов термолабильны. Наиболее пригоден прием разрушения клеток с помощью баллистического проточного дезинтегратора.

Микросомальную фракцию выделяют из гомогената известным образом, например, дифференциальным центрифугированием. Однако применимы и другие технологии.

Использование предложенного способа позволяет получать микросомальную фракцию с повышенной ферментативной активностью ферментативная активность, например, цитохромов составляет 100-120 нмолей продукта/мин х нмоль Р-450, что существенно превышает ферментативную активность микросомальной фракции, получаемой известным способом.

Полученный результат может быть достигнут только при использовании всех отличительных признаков способа и не достигается при несоблюдении хотя бы одного условия.

Значение величины посевной дозы для повышения ферментативной активности дрожжевых микросом показано в следующей таблице, из результатов которой вытекает, что снижение посевной дозы вдвое против оптимальной приводит к снижению ферментативной активности на 30%
На фиг. 1 показана индукция цитохрома Р-450 в дрожжах С.maltosa ВСБ-569 (а) и ВСБ-779 (б) при росте на н-алканах (1%) разной длины углеродной цепи и их смеси (С): 1 экспоненциальная фаза роста, 2 стационарная фаза роста.

Отчетливо видно, что использование индивидуального н-декана, как основного субстрата имеет неоспоримые преимущества перед использованием других индивидуальных углеводородов и их смесью; на фиг.2 показаны кривые роста (а) и кривые индукции (б) цитохрома Р-450 при роcте дрожжей С.maltosa на н-декане (1-1 об. 2 2 об. 3 3 об.).

Анализ полученных данных позволяет заключить, что максимальное накопление цитохрома Р-450 имеет место в стационарной фазе роста, а максимальная скорость прироста биомассы достигается в экспоненциальной фазе.

Обращает на себя внимание тот факт, что в биосинтезе цитохрома Р-450 имеется стадия вторичного подъема ферментативной активности, чего добиться до настоящего времени у культуры Candida maltosa не удавалось, хотя при культивировании некоторых других дрожжей этот феномен выявлялся.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что упомянутые закономерности не носят специфического характера, присущего отдельному штамму, а распространяются, по крайней мере, на данный вид микроорганизма.

Представленные данные доказывают, что использование предложенного способа позволяет повысить как суммарную ферментативную активность микросомальной фракции за счет повышения общего уровня накопления фермента, так и удельную ферментативную активность за счет того, что в стационарной фазе роста сохраняется максимальный уровень накопления фермента, а удельный прирост биомассы снижается. В экспоненциальной фазе роста, при достижении которой завершается процесс культивирования в соответствии с известным способом, накопление фермента не достигло максимального уровня, а скорость прироста клеточной массы максимальная.

Экспериментально полученные результаты подтверждают, что культура Candida maltosa только при высокой посевной дозе, только при культивировании до стационарной фазы роста способна обеспечить наиболее высокий полезный результат.

Основное преимущество предложенного способа по сравнению со способом-прототипом состоит в повышении суммарной и удельной ферментативной активности микросомальной фракции дрожжей.

Однако, предложенный способ имеет и другие важные достоинства. Как показали проведенные исследования, при осуществлении предложенного способа, т. е. при культивировании до стационарной фазы роста, углеводородный субстрат (н-декан) утилизируется значительно полнее, чем это наблюдается в известном способе, предусматривающем использование смеси углеводородов и культивирование до станции экспоненциального роста.

Наличие в микросомальной фракции, полученной по предложенному способу, значительно меньшего количества остаточных углеводородов и клеточного белка, чем во фракции, полученной известным способом, имеет серьезное практическое значение. С одной стороны, микросомальная фракция как таковая, которая может быть использована самостоятельно, характеризуется более высокой степенью чистоты и более удобна для использования в любых процессах. С другой стороны, повышенная степень чистоты микросомальной фракции создает более благоприятные условия для дальнейшего выделения из нее индивидуальных ферментов, так как упрощаются методы очистки этих ферментов.

Анализ доступной патентной и научно-технической литературы показал, что совокупность отличительных признаков предложенного способа в аналогичных технических решениях не использовалась.

Что касается отличительных признаков предложенного способа, то можно заметить следующее.

Факт использования повышенных доз посевного материала для интенсификации роста микроорганизмов достаточно хорошо известен. Однако в данном случае априорно не было оснований полагать, что использование этого приема окажет существенное влияние на процесс накопления ферментов.

Известны попытки выращивания некоторых алканокисляющих микроорганизмов на индивидуальных углеводородных как единственном источнике углерода и энергии. Однако при этом лучшим субстратом для изучаемых культур были иные алканы, чем н-декан.

Прием выращивания алканокисляющих культур до стадии стационарного роста, имеющего целью получение ферментных препаратов, ранее не использовался.

Возможность максимального накопления ферментов культурой Candida maltosa при сниженной концентрации биомассы и большей полноте использования углеводорода за счет совместного использования отличительных приемов предложенного способа, однозначно не вытекала из известного уровня знаний.

Все это дает заявителю основания для вывода о соответствии предложенного способа критерию существенных отличий.

П р и м е р 1. Для предварительного получения посевного материала 30 косяков культуры дрожжей Candida maltosa ВСБ-779 из музея ВНИИсинтезбелок, выращенных на скошенном сусло-агаре, пересевали в 20 качалочных колб, содержащих 100 мл жидкой минеральной среды следующего состава: (NH₄)₂HPO₄ 0,5 г/л; NH₄H₂PO₄ 2 г/л; K₂SO₄ 0,2 г/л; MgSO₄ 0,2 г/л; 0,2% автолизат дрожжей 2 мл/л, биотин-10 мкг/л, вода водопроводная, начальное рН 5,5. Также добавляли 50 мкл раствора микроэлементов следующего состава: KI 20 мг/л; Н₃ВО₃ 20 мг/л; MnSO₄ ˙ 5H₂O 20 мг/л; (NH₄)₂MoO₄ 20 мг/л; FeSO₄ ˙ 7H₂O 100 мг/л. Концентрация клеток составляла 0,7-1,5 мг сухой биомассы/л. В качестве источника углерода использовали н-декан (2 мас.). Культи- вировали 24 ч при 30^оС на качалке (n=200 об/мин) до стационарной фазы роста. Полученный посевной материал использовали в качестве инокулята для засева ферментера.

Для засева ферментера использовали 2 л посевной культуры с концентрацией 3,8 г/л, что обеспечивало конечную концентрацию культуры в ферментере 1,3 г/л. Инокулят вносили в ферментер с рабочим объемом 6 л, содержащий жидкую минеральную среду следующего состава: Н₃РО₄ 1,6 г/л; KCl 0,98 г/л; MgSO₄ 0,7 г/л; FeSO₄x x7H₂O 0,134 г/л; ZnSO₄ ˙ 7H₂O 0,029 г/л; MnSO₄ ˙ 5H₂O 0,017 г/л; 0,2% автолизат дрожжей 3 мл/л; 2 мас. н-декана. рН среды поддерживался автоматически на уровне 4,2-4,3 титрованием 6% NH₄OH, перемешивание 1600 об/мин; рО₂ на протяжении процесса поддерживали на уровне 10-20% от полного насыщения, а с 18 часа культивирования уровень рО₂ снижали до 1-5% Выращивание проводили 24 ч при 30^оС. Клетки собирали в стационарной фазе роста после самопроизвольного увеличения рО₂ среды.

После 24 ч культивирования клетки отделяли центрифугированием при 3000 об/мин и промывали холодной (4^оС) водой. Получено 380 г прессованной биомассы дрожжей с удельным содержанием цитохрома Р-450 31 нмоль/г прессованных дрожжей, что соответствует 100-110 нмолям Р-450/г сухой биомассы. Общее содержание цитохрома Р-450 составило 11780 нмолей. Отмытые клетки дрожжей суспендировали до концентрации 100 г сухих дрожжей/л в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 3 мМ ФСМФ (фенилметилсульфонилфторида), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ и разрушали в проточном баллистическом дезинтеграторе при скорости протока 60 л/ч (n=1500 об/мин), температура 2-4^оС в течение 40 мин.

К гомогенату добавляли сахарозу и глицерин до концентрации 0,25 М и 20% соответственно, после чего центрифугировали при 23000 xg в течение 20 мин. Осадок отбрасывали, а супернатант, содержащий 8250 нмолей цитохрома Р-450 с общей активностью 840 мкмолей продуктов/мин (что соответствует удельной активности гидроксилирования н-алкана 102 нмоля продукта/мин) использовали для получения микросомальной фракции.

Супернатант (23000 х g) подвергали центрифугированию при 105000 xg в течение 120 мин. Полученный супернатант отбрасывали, а осадок представлял собой микросомальную фpакцию дрожжей Candida maltosa, содержащую 6700 нмолей цитохрома Р-450,что составляет 56,9% от исходного содержания в клетках дрожжей. Ферментативная активность полученной микросомальной фракции после промывки 0,1 М калий-фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 20% глицерина, 0,15 М KCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, составляла: цитохром Р-450 0,79 нмоля/г белка (активность гидроксилирования 96 нмолей продукта/мин х нмоль Р-450);
алкогольоксидаза высших спиртов 1,5 мкмоля О₂/мин х мг;
эпоксидгидраза 6,8 нмоля/мин х мг белка;
НАДФH-цитохром Р-450 редуктаза 0,5 мкмоля цит.С/мин х мг;
цитохром b₅ 1,0 нмоля/мг белка.

П р и м е р 2. Для предварительного получения посевного материала 30 косяков культуры дрожжей Candida maltosa ВСБ-569 из музея ВНИИсинтезбелок, выращенных на скошенном сусло-агаре, пересевали в 20 качалочных колб, содержащих 100 мл жидкой минеральной среды следующего состава: (NH₄)₂HPO₄ 0,5 г/л; NH₄H₂PO₄ 2 г/л; K₂SO₄ 0,2 г/л; MgSO₄ 0,2 г/л; 0,2% автолизат дрожжей 2 мл/л, биотин-10 мкг/л, вода водопроводная, начальное рН 5,5. Также добавляли 50 мкл раствора микроэлементов следующего состава: KI 20 мг/л; Н₃ВО₃ 20 мг/л; MnSO₄ ˙ 5H₂O 20 мг/л; (NH₄)₂MoO₄ 20 мг/л; FeSO₄ ˙ 7H₂O 100 мг/л. Концентрация клеток составляла 0,7-1,5 мг сухой биомассы/л. В качестве источника углерода использовали н-декан (2 мас.).

Культивировали 23 ч при 30^оС на качалке (n=200 об/мин) до стационарной фазы роста. Полученный посевной материал использовали в качестве инокулята для засева ферментера.

Для засева ферментера использовали 2 л посевной культуры с концентрацией 4,5 г/л, что обеспечивало конечную концентрацию культуры в ферментере 1,5 г/л. Инокулят вносили в ферментер с рабочим объемом 6 л, содержащий жидкую минеральную среду следующего состава: H₃PO₄ 1,6 г/л; KCl 0,98 г/л; MgSO₄ 0,7 г/л; FeSO₄x x7H₂O 0,134 г/л; ZnSO₄ ˙ 7H₂O 0,029 г/л; MnSO₄ ˙ 5H₂O 0,017 г/л; 0,2% автолизат дрожжей 3 мл/л; 2 мас. н-декана. рН среды поддерживался автоматически на уровне 4,2-4,3 титрованием 6% NH₄OH, перемешивание 1600 об/мин; рО₂ на протяжении процесса поддерживали на уровне 10-20% от полного насыщения, а с 18 часа культивирования уровень рО₂ снижали до 1-5% Выращивание проводили 25 ч при 30^оС. Клетки собирали в стационарной фазе роста после самопроизвольного увеличения рО₂ среды.

После 25 ч культивирования клетки отделяли центрифугированием при 3000 об/мин и промывали холодной (4^оС) водой. Было получено 400 г прессованной биомассы дрожжей с удельным содержанием цитохрома Р-450 33 нмоль/г прессованных дрожжей, что соответствует 105-120 нмолям Р-450/г сухой биомассы. Общее содержание цитохрома Р-450 составило 13200 нмолей. Отмытые клетки дрожжей суспендировали до концентрации 110 г сухих дрожжей/л в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,4), содержащем 3 мМ ФСМФ (фенилметилсульфонилфторида), 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ и разрушали в проточном баллистическом дезинтеграторе при скорости протока 60 л/час (n=1500 об/мин), температуре 2-4^оС в течение 45 мин.

К гомогенату добавляли сахарозу и глицерин до концентрации 0,25 М и 20% соответственно, после чего центрифугировали при 23000 х g в течение 20 мин. Осадок отбрасывали, а супернатант, содержащий 8500 нмолей цитохрома Р-450 с общей активностью 780 мкмолей продуктов/мин (что соответствует удельной активности гидроксилирования н-алкана 92 нмоля продукта/мин) использовали для получения микросомальной фракции.

Супернатант (23000 х g) разводили 0,1 М калий-фосфатным буфером, содержащим 20% глицерина, 1 мМ ЭДТА и 1 мМ ДТТ до концентрации белка 12-15 мг/л, добавляли 25%-ный раствор полиэтиленгликоля ПЭГ-6000 до концентрации 6% выдерживали 30 мин и центрифугировали при 8000 х g 30 мин. Полученный супернатант отбрасывали, а осадок представлял собой микросомальную фракцию дрожжей Candida maltosa, содержащую 6900 нмолей цитохрома Р-450, что составляет 52,3% от исходного содержания в клетках дрожжей. Ферментативная активность полученной микросомальной фракции после промывки 0,1 М калий-фосфатным буфером (рН 7,5), содержащим 20% глицерина, 0,15 М KCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, составляла:
цитохром Р-450 0,10 нмоля/мг белка (активность гидроксилирования 110 нмолей продукта/мин х нмоль Р-450);
алкогольоксидаза высших спиртов 1,0 мкмоля О₂/мин х мг;
эпоксидгидраза 7,2 нмоля/мин х мг белка;
НАДФН-цитохром Р-450 редуктаза 0,42 мкмоля цит.С/мин х мг;
цитохром b₅ 1,5 нмоля/мг белка.

Таким образом, все изложенное позволяет заключить, что предложенный способ, обеспечивающий активность микросомальной фракции на уровне 100 нмолей продукта/нмоль Р-450 х мин в 5-10 раз превышает эффективность всех известных способов получения микросом, гарантирующих ферментативную активность этих фракций на уровне не превышающем 8-10 нмолей продукта/нмоль Р-450 х мин.

Использование: биотехнология. Сущность: алканокислящие дрожжи Candida maltosa культивируют в ферментационной среде, содержащей в качестве источника углерода и энергии н-декан, до перехода культуры в стационарную фазу роста. При этом посевной материал вносят в конечной концентрации не менее 1,3 г/л. Затем биомассу отделяют, разрушают и выделяют микросомальную фракцию. Способ позволяет получить микросомальную фракцию с высокой ферментативной активностью и высоким содержанием цитохрома Р-450. 2 ил., 1 табл.

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИКРОСОМАЛЬНОЙ ФРАКЦИИ АЛКАНОКИСЛЯЮЩИХ ДРОЖЖЕЙ CANDIDA MALTOSA, включающий выращивание посевного материала, внесение его в ферментационную среду, содержащую алканы как источник углерода и энергии, с последующим культивированием, отделением биомассы, ее разрушением и выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения ферментативной активности целевого продукта, посевной материал вносят до концентрации в ферментационной среде не менее 1,3 г/л, в качестве источника углерода и энергии используют н-декан, а культивирование осуществляют до стационарной фазы роста.