Способ получения глюкоамилазы и белкового корма Советский патент 1984 года по МПК C12N9/34 C12P39/00 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и может быть использовано для получения ферментных препаратов глюкоамилазы и белкового кормового продукта в условиях безотходного производства.

Известны способы интенсификации технологических процессов при производстве продуктов микробиологичес,кого синтеза путем совместного культивирования микроорганизмов.

Например, известен способ получения лизина, которьй предусматривает подсев в культуральную жидкост с остаточной концентрацией Сахаров около 3% на логарифмической стадии роста продуцента не ассимилирующих лизин микроорганизмов Trichosporon Cutaneum М-19 или Candida tropicaiis в количестве 0,1-1,2 вес.% ij.

Однако микроорганизмы подсевают в культуральнуго жидкость без учета оптимальных параметров их развития, не учитывается потребность подсеваемых микроорганизмов в дополнительном минеральном азотном и фосфорном питании, способствующем ускорению роста и более полному условию остаточных Сахаров. Кроме того, подсев микроорганизмов в логарифмической фазе тормозит биосинтез ферментов .

Известен также способ получения амилолитических ферментов, предусматривающий совместное выращивание продуцента Aspergillus oryrae и дрожжей Saccharomyces cerevisiae пр рН 5,3-3,5 в течение 20-40 ч 23.

Способ не позволяет получить амилолитические ферменты высокой активности, так как при совместном культивировании с одновременным засевом грибов и дрожжей последние, имея более короткий цикл развития, быстрее и в большем количестве потребляют углеводы, а биосинтез глюкоамилазы не обедненной питательной среде замедляется. Способ не предусматривает утилизации остаточных непотребленнЫх Сахаров.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ получения концентрированных ферментных препаратов, в том числе глюкоамилазы, предусматривающий глубинное культивирование продуцента из рода Aspergillus с подсевом культуры

дрожжевого организма вида Saccharomyces cerevisiae в культуральную жидкость и утилизацию остаточных сахароз дрожжами. Культивирование ведут при начальном рН 3,8-5,6 , температуре 30-35 С в течение 72144 ч до получения активности по глюкоамилазе 20-200 ед./мл. Подсев дрожжей осуществляют после отделения биомассы гриба, срабатывание ведется в аназробных условиях в течение 24 ч до содержания остаточных Сахаров 0,5-1,0% и концентрации спирта 3-5 об.%. Затем осуществляют концентрирование ферментно-спиртовой смеси ультрафильтрацией или выпариванием до получения концентрирован-ного ферментного препарата и спирта ПЗ J.

Способ не позволяет получить высокого содержания белка в биомассе из-за наличия в культуральной жидкости после сбраживания остаточных Сахаров (0,5-1%).

Применение способа на заводах миробиологической промьпиленности неэкономично .

Цель изобретения - создание безотходного производства, снижение себестоимости и улучшение качества целевого продукта, а также повьш1ени выхода белкового корма.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения глюкоамилазы и белкового корма, предусматривающему глубинное культивирование продуцента из рода Aspergillus с подсевом культуры дрожжевого организма вида Saccharomyces cerevisiae в культуральную жидкость и утилизацию остаточных Сахаров дрожжами, подсев дрожжей осуществляют в стационарной фазе развития продуцента, причем перед подсевом в культуральную жидкость добавляют азотное и фосфорное питание, рН корректируют до значения 3,5-6,0 и после совместного культивирования при аэрации в течение 10-15 ч ферментный раствор и биомассу высушивают отдельно. В качестве пйдсеваемого дрожжевого микроорганизма используют дрожжи из рода Candida,

Фосфорное и/или азотное питание осуществляют добавлением 10%-ного стерильного раствора диаммонийфосфата или аммиака. Способ осуществляется следующим образом. Продуценты глюкоамилазы из рода Aspergillus культивируют на концентрированных питательных средах в аэробных условиях при ЗО-ЗЗ С и начальном значении рН 4,8-6,0 в течение 84-150 ч. За 10-50 ч до максимального образования глюкоамилазы на стационарной фазе развития продуцента в культуральную жидкость вводят стерильный раствор, содержащий источники азота и фосфора из расчета ожидаемого выхода воздушно-сухой юиомассы подсеваемых микро организмов по отношению к остаточным сахарам {соотношение остаточных Сахаров, азота и фосфора рассчиты вают по содержанию их в биомассе подсеваемых микроорганизмов), проверяют рН и доводят его значение до 3,5-6,0 добавлением стерильного раствора кислоты или щелочи. Подсевают культуру микроорганизмов, утилизирующих остаточные сахара, напри мер дрожжи рода Candida или Saccharoitiyces, и проводят совместное куль тивирование при оптимальных условия для развития дрожжей, т.е. при 3035° С, подаче воздуха 0,5-1,5 м /м мин до прекращения размножения дрожжей (10-50 ч). Из полученной культураль ной жидкости отделяют биомассу, например фильтрацией, и сушат раздель но ферментный раствор, содержащий глюкоамилазу, и биомассу. П р и м е р 1 , Продуцент глюкоамилазы Aspergillus niger Т-33 кул тивируют в колбах на качалке при 33°С в ЮО мл концентрированной питательной среды, содержащей источни ки углеводов, азота, фосфора и биостимуляторы, при начальном значении рН 5,4. После 120 ч роста (за 30 ч до максимального накопления глюкоамилазы) активность глюкоамилазы в культуральной жидкости составляет 110 ед./мл, остаточные сахара (по РВ) 4,5%, сухие вещества (СВ) 8,2%, рН 3,3. В полученную культуральную жидкость на стационарной фазе развития продуцента добавляют дополнитель ное азотное и фосфорное питание в виде 10%-ного стерильного раствора диаммоний фосфата в количестве 0,9% соли из расчета ожидаемого выхода воздушно-сухой биомассы дрожжей 45% от РВ, содержащей 3,5% фосфора и 8% азота, доводят значение рН до 4,8 добавлением стерильного раствора щелочи, вводят посевной материал дрожжей Saccharomyces cerevis iae Т-7, выращенный на сусле, и проводят совместное культивирование в течение 30 ч при 30°С и подаче воздуха мин до прекращения размножения дрожжей. Полученная культуральная жидкость имеет ГлС 105 ед./мл, остаточные сахара (по РВ) 0,26%, СВ 4,8%. Из полученной культуральной жидкости от.деляют биомассу фильтрованием и из фильтрата после высушивания его на распылительной .сушилке с наполнителем Na., 50(150% по СВ) получают препарат технической глюкоамилазы с активностью 780 ед./г. После высушивания биомассы получают 4,3 г/100 мл сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 44,1%. Приме р 2 Продуцент глюкоамилазы Aspergillus niger Т-33 культивируют при тех же условиях ,что в примере 1. В культуральную жидкость с той же характеристикой, что в примере 1, вводят посевной материал дрожжей Saccharomyces cerevisiae раса 14 и проводят совместное культивирование при тех же условиях, что в примере 1. Полученная культуральная жидкость имеет 112 ед./мл, РВ 0,22%, СВ 4,3. После отделения биомассы и сушки фильтрата с наполнителем NaC1 (150% по СВ) получают препарат технической глюкоамилазы с ГлС 820 ед./г. После высушивания биомассы получают 4,4 г/100 мл сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 43,9%. П р и м е р 3. Продуцент глюкоамилазы Aspergillus awamori F- 122 культивируют 6 биолафите на концентрированной питательной среде при 35°С и начальном значении рН 4,8. После 67 ч роста (за 30 ч до максимального накопления глюкоамилазы) в КЖ ГлС 175. ед./мл, РВ 4,7%, СВ 5,0%, рН 2,9. Полученную культуральную жидкость до подсева обрабатывают так же, как в примере 1, вводят посевной материал дрожжей Saccxaromyces cerevisiae раса ХП, выращенных на сусле, и проводят совместное культивирование в течение 30 ч при З2с и подачеО,5 м/м. мин до прекращения размножения дрожжей,. Полученная культуральная жидкость имеет ГлС 168 ед./мл, РВ 0,27%, СВ 3,9%. Биомассу опреде ляют фильтрацией и фи,пьтрат сушат па распылительной сушилке с наполнителем (200% по отношению к СВ). Полученный препарат технической глюкоамилазы имеет ГлС 950 ед./г. После высушивания биомассы получают 4,1 г сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 43,2%, П р и м е р 4. Продуцент глюкоамилазы Asp. niger Т-33 культивируют в тех же условиях, что в примере 1,. После 140 ч роста (за 10 .ч до максимального накопления глюкоамилазы) культуральная жидкость характеризуется активностью -глюкоамилазы 115 ед,/мл, РВ 5,2%, СВ 7,9%, рН 3,1. Полученную культуральнуто жидкость обрабатывают, как в примере 1, после чего вводят посевной материал дрожжей Candida tropicalis СК-4, вьфащенных на сус ле, и культивируют совместно в течение 10 ч при и подаче возду ха 1,5 до прекращения размножения дрожжей. Полученная культуральная жидкость имеет актив ность глюкоамилазы 115 ед./мл, остаточного сахара (по РВ) 0,35%, СИ 4,6%. Культуральную жидкость фштьтру-ют и из фильтрата путем выс шивания его на распылительной сушилке с добавлением наполнителя N82504(150% по отношенрш к СВ) получают препарат технической глюкоамилазы с активностью 850 ед,/г. Биомассу высушивают и получают 4 г (из 100 мл культуральной жидкости) сухого белкового корма с содержани ем Cfjporo протеина 43%. П р и м е р 5о Продуцент глюкоамилазы Asp. awamori А-1 культивируют в колбах на качалке при 30°С в 100 мл концентрированной среды, содержащей те же источники питател ных веществ, что в примере 1, но при начальном значении рН 6,0, После 74 ч роста (за 10 ч до макси мального образования глюкоамилазы) на стационарной фазе развития продуцента культуральная жидкостьга еет след, характеристику: ак тивность глюкоамилазы 128,8 е./мл остаточные сахара (по РВ) 6,6%, 36 СВ 10,8%, рН 5,1. Перед подсевом дрожжей в Культуральную жидкость вводят 1,3% диаммонийфосфата в виде стерильного раствора (из расчета, как в примере 1), доводят рН до 6,0 и в стерильных условиях засевают посевным материалом дрожжей Candida itilis, предварительно выращенных на сусле. Совместное культивирование продолжают при 33 С и подаче воздуха 1,0м/м -мин до прекращения размножения дрожжей (10 ч). Получают Культуральную жидкость с активностью глюкоамилазы 136 ед./мл, содержанием остаточного сахара (по РВ) 0,25% и СВ 4,8%. Биомассу отделяют фильтрованием, высушивают и получают 4,2 г (из 100 мл культуральной жидкости) воздушно-сухого белкового корма с содержанием сырого протеина 44,8%. Фильтрат культуральной жидкости высушивают на распылительной сушилке с добавлением наполнителя NaCl (100% по СВ) и получают препарат технической глюкоамилазы с активностью 960 ед./мл. П р и м е р, 6. Продуцент глюкоамилазы Asp. awamori F-122 выращивают при 35 С в ферментере полезной емкостью 35 л на концентрированной питательной среде, содержащей те же источники питания, что в примере 1, но при начальном значеНИИ рН 4,8. После 67 ч роста продуцента в стационарной фазе развития его (за 50 ч до максимального накопления глюкоамилазы) в культуральной жидкости накапливается 168,8 ед./мл глюкоамилазы, а содержание остаточных Сахаров снижается до 4,62%, СВ составляет 10,2%, рН 2,95. Перед подсевом дрожжей в ферментер вводят раствор аммиака 0,56% (из расчета, как в примере 1) и доводят рН до 3,5 раствором ортофосфорной кислоты. В Культуральную жидкость в стерильных условиях подсевают посевной материал дрожжей Candida irboreae, выращенных на сусле. Совместное культивирование проводят при 30°С и подаче воздуха 0,5 м/м. мин в течение 50 ч до прекращения размножения дрожжей. Получают Культуральную жидкость активностью глюкоамилазы 185ед,/мл содержанием остаточных Сахаров (по РВ) 0,32%, СВ 6,1%. Биомассу отделяют фильтрованием и сушат, а фильтрат очищают и концентрируют с последующим высушиванием на распылительной сушилке с добавлением наполнителя NaCI (100% по СВ). Получают препарат очищенной глюкрамилазы с активностью 4750. ед./мл и 45 г возду но-сухого белкового корма (.из 1 л культуральной жидкости) с содержание сырого протеина 42,8%. Пример (контроль),. Продуцент глюкоамилазы Asp. awamori F-122 культивируют в колбах на качалке при 35°С в 100 мл концентрированной питательной среды,содержащей источники углеводов, азота, фосфора и стимуляторы роста. В середине логарифмической фазы развития продуцента (45 ч ферментации) культуральная жидкость имеет следующую характеристику: актив ность глюкоамилазы 105 ед./мл, остаточные сахара (по РВ) 4,8%, СВ 9,7%, рН 2,9. В культуральную жидкость вносят посевной материал дрожжей Candida tropicalis СК-4 и осуществляют совместное культивирование при и аэрации 1,0 м /м -мин, поддерживая рН среды 6,5. Процесс культивирования продолжают до минимального содержания сахароз в куль738туральной жидкости (в среднем 112 ч). Полученная культуральная жидкость имеет глюкоамилазнуто активность 88,2 ед./мл, остаточные сахара (по РВ) 1,25%, СВ 5,7%. Из культуральной Ж1едкости выделяют биомассу, а фильтрат упаривают до содержания сухих веществ 32,9%, а затем сушат на распылительной сушилке. В процессе высушивания препарат налипает на стенки сушилки. Таким образом, используя предлагаемый способ получения глюкоамилазы и белкового корма, можно .получить порошкообразные ферментные препараты технической глюкоамилазы при культивировании высокоактивных продуцентов на концентрированных питательных средах товарного вида} создать безотходное производство препаратов глюкоамилазы; улучшить качество препаратов глюкоамилазы по гигроскопичности получить белковый кормовой продукт, по содержанию сырого протеина соответствующий БВК; снизить себестоимость препаратов глюкоамилазы на 10-15%. . Ожидаемый годовой экономический эффект от внедрения предлагаемого способа составит 3582,36 тыс.руб.

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛЮКОАМИЛАЗЫ И БЕЛКОВОГО КОРМА, предусматривающий глубинное культивирование продуцента из рода Aspergillus с подсевом культуры дрожжевого организма вида Saccharomyces cerevisiae в культуральную жидкость и утилизацию остаточных Сахаров дрожжами, отличающийся тем, что, с целью создания безотходного производства, снижения себестоимости и улучшения качества целевого продукта, а также повышения выхода белкового корма, подсев дрожжей осуществляют в стационарной фазе развития продуцента, причем перед подсевом в культуральную жидкость добавляют фосфорное, азотное питание, рН корректируют до значения 3,5-6,0 и после совместного культивирования при аэрации в течение 10-15 ч ферментный раствор и биомассу высушивают i СУ) отдельно. 2.Способ по п. 1, отличающийся тем, что в качестве подсеваемого дрожжевого микроорганизма используют дрожжи из рода Candida. 3.Способ по п. 1, отличающийся тем, что фосфорное и/или азотное питание осуществляют добавлением 10%-ного стерильного расо м створа диаммонийфосфата или аммиака. О5 vl со