Штамм вируса гепатита А для накопления биомассы, используемой для приготовления профилактических и диагностических препаратов Советский патент 1989 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к вирусологии и предназначено для диагностики и вакцинопрофилактики вирусных инфекций, а именно инфекции вируса гепатита А (ВГА).

Цель изобретения - получение штамма ВГА, способного к размножению в перевиваемой культуре клеток с накоплением вирусной массы в количествах, достаточных для разработки профилактических и диагностических препаратов.

Штамм ВГА Л-2424 выделен из собранных за шесть дней до желтухи фекалий больного гепатитом.

Штамм ВГАЛ-2424 депонирован под № 177 в коллекции Государственного института стандартизации и контроля

медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича.

Штамм ВГАЛ-2424 характеризуется следующими свойствами.

Частицы ВГА по данным электронной «микроскопии имеют нм. Основная масса частиц имеет плавучую отность 1,34 г/см3 в градиенте хлористого цезия и коэффициент седиментации 155-160 Szoyv - в градиенте нейтральной сахарозы.

По данным иммуноферментного анализа (ИФА) титр антигенной активности составляет 1:16-1:32. По данным иммуноэлектронной микроскопии (ИЭМ) вирусные частицы взаимодействуют с предварительно аттестованной анти- ВГА сывороткой с образованием харакЈд

4ь

20

тёрного венчика из антител вокруг частиц. Следовательно и по известным морфологическим,, Физико-химическим и антигенным свойствам штамм Л-2424 ,. не отличается от естественно циркулирующего в природе ВГА. Содержащийся в 10%-ном фекальном экстракте вирус пассируют три раза в перевиваемой культуре клеток почек эмбриона JQ макаки резус (линия FRhK-4), а затем три раза - в перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647.

Штамм ВГА Л-2424 представляет f5 собой взвесь заряженных вирусом клеток почек зеленой мартышки 4647, собранных после заражения на 21 сут инкубации при 37° С. Титр инспекционной активности составляет 10T|i ТкИД50/мл, а титр антигенной активности равен 1:16-1:32. Морфологические (форма и размер частиц икосаэдр 27 нм) э физико-химические (пла- вучая плотность 1,34 г/см и коэф- s фициент седиментации 155-160 ) и серологические свойства (способность взаимодействовать с антителами) штамма Л-2424 соответствуют характеристикам циркулирующих в природе штаммов ВГА„ Полученный штамм Л-2424 ВГА при размножении в культурах клеток FRhK-4 и 4647 является продуцент ом вирусного антигена для специфической диагностики гепатита А. При размножении в разрешенной 35 для вакционного производства культуре клеток 4647 штамм ВГА Л-2424 используют для накопления вирусной массы при производстве инактивирован- ной вакцины против гепатита А. 40

Пример 1„ Штамм ВГА Л-2424 - продуцент вирусного антигена для специфической диагностики гепатита А.

Собранные за шесть дней до желту- 45 хи фекалии больной с клинически выраженным диагнозом гепатита А гомогенизируют в 0,1 М фосфатно-солевом буфере рН 7,4 в гомогенизаторе в виде 10%-ной суспензии, добавляют сп равный объем охлажденного (0°С) фрео-- на-113, экстрагируют в течение 10 мин и центрифугируют для расслоения фаз при 1500 об/мин в течение 10 мин. Полученный фекальный экстракт со30

55

держит вирусные частицы размером 27-30 нмэ которые взаимодействуют с предварительно аттестованной сывороткой с образованием характерного вен0

,. Q

5 s 35 40

45 сп -

0

55

чика из антител (данные ИЗМ). По данным изоциклического центрифугирования в хлористом цезии основная популяция части имеет плавучую плотность 1,34 г/см3. Коэффициент седиментации этих частиц равен 155- 160 S20iVV как следует из данных центрифугирования (35000 об/мин, 2 ч, 5 С) в градиенте плотности сахарозы (10-35%). Вирусные частицы способны взаимодействовать с анти-ВГА антителами, как следует из данных ИФА и ИЭМ.

В 10%-ный фекальный экстракт добавляют по 100 ед/мл пенициллина и стрептомицина, а также канамицин до конечной концентрации 100 мкг/мл и выдерживают при 37 С в течение 4 ч, полученную смесь инокулируют в течение 2 ч при 37 С на предварительно хорошо сформированный монослой перевиваемых клеток почек эмбриона макаки резус (линия FRhK-4). В качестве среды роста применяют среду Игла- МЕМ с удвоенным содержанием аминокислот и витаминов (Игла-2МЕМ), содержащую 10% эмбриональной телячьей сыворотки, а в качестве среды поддержания - среду Игла-2МЕК с 1% эмбриональной телячьей сыворотки. Среду поддержания меняют один раз в неделю. Через 42 дня инкубации при 37°С сливают с монослоя клеток культуральную жидкость, монослой промывают раствором Хенкса и снимают клетки в среде |Игла-2МЕМ без сыворотки после пред- варительной кратковременной обработки монослоя клеток 0,02%-ным раствором ЭДТА. Содержащийся в культураль- ной жидкости вирус концентрируют путем осаждения 10%-ным полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000) в течение 16 ч при 4С, собранный при центрифугировании осадок (1000 об/мин, 30 мин) восстанавливают в 1/30 объема исходной культуральной жидкости, и полученный концентрат обдъединяют с ли- затом заряженных клеток. Клетки разрушают путем пятикратного замораживания (70°С) и оттаивания (+10°С). Объединенную таким образом смесь используют в качестве инокулята для следующего пассажа вируса. На уровне 4 пассажа срок рамножения (21 сут) и продукция вируса как по антигенной (титр 1 :64), так и по инфекционной (10T|Sr TKH/IJO/MA ) ак

5

тивности близки аналогичным параметрам для системы HAS-15/FRhK-4. Уровень продукции вирусного антигена достаточен для изготовления диагностических препаратов к гепатиту А. i

Пример 2. Штамм ВГА Л-2424 продуцент вирусной массы для изготовления инактивированной вакцины для специфической профилактики гепатита А.

Выделение вируса из фекалий и адаптации штамма Л-2424 к размножению в культуре клеток FRhK-4 проводят как описано в примере 1, но штамм ВГА Л-2424 адаптируют к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647.

Адаптацию штамма Л-2424 в культур клеток 4647 проводят следующим образом.

Хорошо сформированный монослой клеток 4647 инокулируют в течение 2 ч при 37°С вирусосодержащим материалом, полученным путем разрушения 5-кратным замораживанием (оттаиванием зараженных клеток, собранных на 44 сут третьего пассажа штамма ВГА Л-2424 в культуре клеток FRhK-4) Для последующего пассирования вируса используют лизат зараженных штаммом ВГА Л-2424 клеток, собранных на максимальный срок размножения предыдущего пассажа. В качестве среды роста и среды поддержания используют среду Игла-2МЕМ 10% и эмбриональ- ной телячьей сы§оротки 1%. Условия культивирования те же, что и в примере 1, за исключением температуры инкубации. Как видно из,описанных данных, по мере пассирования происходит адаптация штамма ВГА Л-2424 к культуре 4647. Достигнутый на уровне

-

5

41

716

третьего пассажа штамма ВГА Л-2424 уровень продукции вируса сопоставим с ранее описанным для систем HAS-15/4647, что позволяет создавать препараты инактивированной вакцины

против гепатита А. i

Данные адаптации штамма вируса

гепатита А Л-2424 к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647 приведены в таблице.

Формула изобретения

Штамм вируса гепатита А ГИСК №177 для накопления биомассы, используемой для приготовления профилактических и диагностических препаратов.

20

25

30

35

В качестве инокулума используют вирус, полученный на 44 сут в резуль- тате третьего пассажа в культуре клеток FRhK-4 (пример 1).

Изобретение относится к вирусологии, а именно к диагностике и вакцинопрофилактике гепатита А (ВГА). Цель изобретения - получение первого отечественного штамма ВГА, способного к размножению в перевиваемой культуре клеток с накоплением вирусной массы в количествах, достаточных для разработки профилактических и диагностических препаратов. Штамм ВГА Л-2424 депонирован в коллекции ГИСК под N177 и характеризуется свойствами, присущими ВГА. Штамм адаптирован к перевиваемой культуре клеток почек зеленой мартышки 4647, причем уровень продукции достаточен для разработки инактивированной вакцины против ГА и пригоден для специфической диагностики ВГА. 1 табл.