Штамм VIRUS нератIтIS А номINIS для приготовления вакцинных и диагностических препаратов Советский патент 1993 года по МПК C12N7/00 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и касается получения быстрорастущего штамма вируса гепатита А (ВГА). Этот штамм может быть использован в профилактических и диагностических целях в медицине.

Целью изобретения является получение в культуре клеток быстрорастущего штамма ВГА, способного образовывать бляшки, что значительно упрощает и удешевляет работу при получении диагностических и профилактических препаратов.

Штамм ВГА МБ-7 депонирован под N 213 в коллекции Государственного института стандартизации и контроля медицинских и биологических препаратов им. Л.А.Тарасе вича.

Штамм получен из фекалий больного с клинически выраженными признаками гепатита А в 1988 г. Приготовленную 10% суспензию фекалий на 0,1 М Na-фосфатном буфере (рН 7,4)ресуспендируют, центрифугируют в течение 10 мин при 1500-2000 об/мин. Супернатант фильтруют через фильтр 0,22 мкм (производство Mlllipore), фасуют по 0,5 мл в стерильные флаконы и хранят при температуре (-70±0.5)°С. Полученный супернатант используют в качестве иноку- лята для получения штамма ВГА на клетках FRhK-4.

На сформированный монослой клеток FRhK-4 наносят инокулят. После адсорбции в сосуд добавляют ростовую поддерживающую среду. Через неделю после заражения культуральную жидкость сливают, клетки промывают раствором трипсина-версена и отслоившиеся клетки собирают в натрий-солевом фосфатном буфере. Собранные клетки трижды промораживают и клеточный лизат используют в качестве инокулята для

00

о

о

ю . о

со

следующего пассажа. Уже на втором пассаже в клетках FRhK-4 выявляется антиген.

Антиген также выявляется в процессе адаптации полученного штамма к перевиваемой культуре клеток почки зеленой мартышки 4647 и диплоидной культуре клеток легкого человека Л68. Возможна адаптация штамма и к другим клеточным линиям.

Штамм характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Частицы ВГА, содержащие РНК, по данным электронной микроскопии имеют диаметр 27 нм. Основная масса частиц имеет плавучую плотность 1,34 г/см3 в градиенте хлористого цезия и коэффициент седиментации 155- 160 S20w - в градиенте нейтральной сахарозы.

Культурапьные свойства. Для культивирования штамма ВГА на клетках FRhK-4 используют поддерживающую среду Игла МЭМ, содержащую 5% фетальной сыворотки крупного рогатого скота и антибиотики пенициллин и стрептомицин по 100 ед/мл и 100 мг/мл,соответственно. В качестве ростовой среды для клеток используют ту же среду с 10% фетальной сыворотки и указанными выше концентрациями антибиотиков. Культивирование штамма ВГА МБ-7 на клетках FRhK-4 под покрытием, содержащим 5% бактоагара, на 11-12 сутки приводит к образованию четких бляшек размером 1-3 мм.

Реакцию нейтрализации проводят на уровне пятого пассажа с нейтрализуемым отраслевым стандартным образом (ОСО4) и иммуноглобулинамм, содержащими специфичные антитела к вирусу гепатита A (IgG). В течение 1,5 ч каждое разведение вируса в равных объемах инкубируют с эмбриональной сывороткой плодов коров, с ОСО и фракцией сыворотки рёконвалесцента, содержащей иммуноглобулины класса G(lgG). Затем по 0,2 мл каждого комплекса наносят на слитный монослой клеток FRhK-4 и инкубируют 1,5-2 ч при комнатной температуре. После адсорбции клетки культивируют под покрытием, содержащим 5% бактоагара. Через 10-12 суток на монослое появляются бляшки.

В результате реакции нейтрализации антитела, содержащиеся в ОСО+ и IgG, нейтрализуют часть вирусных частиц в препарате, в результате чего титр вируса в образцах, содержащих ОСО и IgG на порядок отличается от титра исходного вируса.

При иммунизации животных очищенным вирусом отмечается нарастание специфических антител в титрах 1:100-1:1000.

С целью исследования данного штамма на молекулярном уровне был проведен анализ кДНК, полученный на матрице вирусной РНК. с помощью метода амплификации

ДНК. Затравками в процессе амплификации служил набор олигонуклеотидов, выбранных и синтезированных на основе теоретического анализа наиболее консервативных участков РНК нескольких известны4 штамO MOB ВГА, Такой анализ, проведенный с помощью термрстабильной ДНК полимеразы, обнаружил наличие небольшого фрагмента размером около 270 н.п., аналогично фрагменту в составе рекомбинантной плазмиды,

5 содержащей ген белка VP 1 вируса HAS-15, Гибридизационный анализ этого участка с соответствующими мечеными праймера- ми, а также с ник-транслированным фрагментом гена VP 1 в составе рекомбинантной

0 плазмиды дал положительный ответ. Анализируя в ПАА-SDS геле высолоочищенный ВГА штамм МБ-7, выявили при окраске по методу Кумасси три полипептида с относительным . мол. массами 34000 (VP 1), 25500

5 (ур 2) и 23000 (VP 3).

Электронно-микроскопическое исследование с помощью негативного контраста позволило обнаружить частицы вируса гепатита А в клеточном лизате, культуральной

0 жидкости, сконцентрированной в 100 раз и культуральной жидкости, очищенной в градиенте CsCI.

Вирусные частицы имеют типичную морфологию и представляют собой сфери5 ческие частицы с диаметром 25-28 нм. Концентрация в клеточном лизате составляет 10 в.ч./мл, а в очищенной культуральной жидкости - 109 в,ч./мл. Следовательно, по физико-химическим и антигенным свойст0 вам штамм не отличается от естественного циркулирующего в природе ВГА и штамма HAS-15, адаптированного к перевиваемой культуре клеток 4647. Приведенные примеры подробно раскрывают сущность изобре5 тения..

Пример 1. Получение штамма ВГА МБ-7.

Штамм ВГА МБ-7 получают из фекалий больного с.клинически выраженными приО знаками гепатита А. Готовят 10% суспензию фекалий на 0,1 М натрий-солевом фосфатном буфере (рН 7,4), центрифугируют в течение 10 мин при 1500-2000 об/мин.

Профильтрованный через фильтр с диа5 метром пор 0,22 мкм (МИНроге) супернатант фасуют и замораживают с последующим использованием в качестве инокулята.

Культивирование клеток FRhK-4 до формирования монослоя осуществляют на сре- де. Игла МЭМ с 10% фетальной сыворотки и

антибиотиками пенициллином и стрептомицином в количестве 100 ед/мл и 100 мг/мл среды, соответственно.

На предварительно сформированный слитный монослой перевиваемых клеток почки эмбриона макаки резус (FRhK-4) наносят профильтрованную 10% суспензию фекалий и инкубируют при (37±0,5)°С в течение двух часов. Инркулят сливают, монослой промывают раствором Эрла и добав- ляют поддерживающую среду. Через неделю культуральную жидкость сливают, клетки промывают трипсином-версеном дважды и добавляют 0,1 М натрий-солевой фосфатный буфер (рН 7,4). Суспензию кле- ток трижды промораживают при (-70±1,0)°С для более полного разрушения клеток и клеточный лизат используют в качестве иноку- лята для следующего пассажа.

Очищенный вирус получают после трех- кратного замораживания и оттаивания куль- туральной жидкости вместе с клетками. Дебрис удаляют низкоскоростным центрифугированием (2000 об/мин, 0,5-1 ч), добавляют сульфат аммония в расчете 24 г на 100 мл супернатанта. Осадок формируют в холодильнике в течение суток при (4 ±0,5)°С, далее центрифугируют при 8000 g в течение 1-2 ч. Осадок ресуспендируют в необходимом объеме 0,1 М натрий-солевого буфера с рН 7,4. Вирус гепатита А осаждают через подушку 20% раствора сахарозы с последующим центрифугированием в градиенте хлористого цезия.

Пример 2. Культивирование штамма и получение вирусного антигена.

Для культивирования штамма № 213 на клетках FRhK-4 используют среду Игла МЭМ, содержащую 5% эмбриональной сыворотки крупного рогатого скота и антибио- тики, как в примере 1.

Достаточное для определения количество внутриклеточного антигена (по данным ИФА) в клетках FRhK-4 появляется уже на 3 сутки (таблица). Наибольшее количество антигена в этой системе выявляется на 7-8 сутки и составляет 1:64. что сопоставимо с параметрами для системы FRhK-4- HAS-15.

Особенностью заявляемого штамма является способность образовывать крупные бляшки, что значительно упрощает работу. Для получения бляшек штамм культивируют на клетках FRhK-4. Для этой цели клетки выращивают на плоских флаконах объемом 50 мл до формирования слитного монослоя, отмывают раствором Эрла, наносят иноку- лят. Через два часа монослой отмывают и наносят покрытие. В качестве покрытия используют среду Игла МЭМ, 2% фетальной сыворотки и 5% бактоагара. Флаконы инкубируют две недели в термостате при температуре (36,5±0,5)°С, затем монослой окрашивают0,05% раствором кристалла ви- олета, отмывают в течение 1-2 мин проточной водой и подсчитывают бляшки.

Инфекционный титр ВГА на уровне 5-го пассажа составляет (3-5)-10 БОЕ/мл,

Таким образом, результаты эксперимента показали, что заявляемый штамм (быстрорастущий и обладающие цитопати- ческим эффектом) может быть использован при получении вакцинных пррпаратов, а также при получение f -игена в необходимом количеств дл и пользования в различных тест-системах.

Формула изобретения Штамм virus hepatitis A hominis ГИСК № 213 для приготовления вакцинных и диагностических препаратов.

Использование: медицинская вирусология. Сущность изобретения: штамм ГИСК № 213 выделен из фекалий больного и адаптирован к культуре FRhK-4. Инкубационный период внутриклеточного антигена наблюдается в течение 2 сут.;наибольшее количество антигена отмечается на 7-8 сут. и составляет 1:64. Штамм обладает цитопати- ческим эффектом. Инфекционный титр составляет (3-5)-105 БОЕ/мл. Штамм ГИСК N 213, адаптированный к диплоидным клеткам Л-68, обладает иммуногенной активностью. Титр антител у морских свинок составляет 1:100-1:1000. 1 табл.

Продукция антигена ВГА в клетках FRhK-4, определенная в реакции ИФА