Способ определения мембранных нарушений эритроцитов при атеросклерозе Советский патент 1989 года по МПК G01N33/48 G01N33/49 

1

Изобретение относится к медицине, в частности к кардиологии, и может быть использовано для определения мембранных нарушений эритроцитов при атеросклерозе.

Цель изобретения - повышение точности способа за счет проведения последовательной фильтрации крови через мелкопористый фильтр с нарастающими

до 5 мкмоль концентрациями дигитонина, измерения оптической плотности фильтрата при длине волны 410 нм, определения распределения эритроцитов по устойчивости к дигитонину и расчета диагностического показателя,равного соотношению величин оптической плотности фильтрата, полученных при концентрации дигитонина 3 мкмолЬ и

при концентрации дигитонина, вызывающей максимальный гемолиз.

На чертеже показана зависимость оптической плотности фильтрата от концентрации дигитонина.

Способ осуществляют следующим образом.

Венозную кровь с антикоагулянтом разводят физиологическим раствором до клеточной концентрации 0,8%, 1 мл полученной суспензии наносят на стекловолокнистый фильтр, расположенный в термостатируемой при 37°С ячейке, отсасывают водоструйным насосом и один раз промывают 4-10 мл физраствора и отсасыванием экстраклеточной жидкости. После этого на фильтр с промытыми эритроцитами поочередно наливают по 4 мл физраствора с диги- тонином возрастающей концентрации от О до 5 мкмоль (с шагом 0,5 мкмоль/л), инкубируют 30-120 с, отсасывая каждую порцию гемолизата в отдельную пробирку. Содержимое пробирок фотометрируют при 410 ни на спектрофотометре. По данным фотометрирования строят для каждой порции зависимость количества вышедшего из эритроцитов гемоглобина от концентрации дигитонина в этой порции. Эта зависимость отражает кривую распределения эритроцитов по устойчивости к дигитонину (ДУ). За критерий, характеризующий это распреде

ление, принимают отношение оптической плотности при концентрации дигитонина 3 мкмоль/л к оптической плотности в максимуме распределения (,/Дмаке). При значении критерия, превышающем величину 0,43, определяют мембранные нарушения эритроцитов при атеросклерозе.

Пример 1. Больная К., 55 лет поступила в кардиологическое отделение с диагнозом: ишемическая болезнь сердца (ИБС) в стадии обострения, атеросклероз коронарных артерий, церебральный атеросклероз.

Определяют критерий распределения эритроцитов по устойчивости к дигитонину.

Для этого 0,1 мл крови разводят физиологическим раствором до 5,25 мл и 1 мл полученной суспензии с конценрацией эритроцитов 0,8% наносят на стекловолокнистый фильтр GF/F (Whatman, Англия), пропускающий частицы диаметром меньше 0,4 мкм.

Q r 5

0

0

5

0

5

0

5

Подают на фильтр с помощью водоструйного насоса отрицательное давление и отсасывает экстраклеточную жидкость. На осажденные эритроциты наливают 4 мл предварительно прогретого при 37 С физраствора с нулевой концентрацией дигитонина, включают разрежение и фильтрат отбирают в пробирку. Эту процедуру повторяют с растворами дигитонина возрастающей концентрации, отбирая каждый фильтрат в отдельную пробирку. Затем содержимое пробирок фотометрируют на спектрофотометре при длине волны410нм. Результаты фотометрирования наносят на график. Затем находят показатель распределения эритроцитов по ДУ. ДУ - Д,/Дма,с 0,28/0,35 0,8 (норма 0,237), доверительная граница 0,43 при уровне значимости 0,05.

Полученный показатель далеко выходит за доверительную границу и в 3,38 раза отличается от нормы. Следовательно, им с большой степенью вероятности выявляют мембранные нарушения эритроцитов у данной больной атеросклерозом.

Пример 2. Больной Д. ,Ч63 года, поступил в кардиологическое отделение с диагнозом: ИБС, атеросклероз коронарных сосудов и аорты.

Расчет показателя ДУ дает следующую величину: ДУ fl,/flMO|KC 0,22/ /0,,52 (норма 0,237, доверительная граница 0,43).

Полученный показатель в 2,19 раза превышает норму и выходит за доверительную границу и, следовательно, с большей достоверностью позволяет определить мембранные нарушения эритроцитов данного больного атеросклерозом.

Пример 3. Больной М., 64 года, поступил в клинику с выраженными болями за грудиной. Поставлен предварительный диагноз: ИБС, стенокардия напряжения, ФКШ, атеросклероз коронарных артерий.

Расчет показателя дигитонинустой- чивости «дает следующую величину ДУ Д, 0,344/0,80 0,43 (норма 0,237, доверительная граница 0,43).

Полученный показатель в 1,79 раз превышает норму и не отличается от значения доверительной границы. Следовательно, вероятность правильного вывода о наличии мембранных нарушений эритроцитов составляет 95%.

51-i

Дополнительные инструментальные методы обследования позволили установить у больного диагноз атеросклероза коронарных артерий.

Пример 4. Больной В., 34 года, поступил в кардиологическое отделение с диагнозом: нейроциркулятор- ная дистония.

Расчет показателя ДУ дает следующую величину: ДУ Д,/Д/иакс 0,30/ /0,85 0,255 (норма 0,237, доверительная граница 0,43).

Полученный показатель в 1,07 раза превышает норму, но не выходит за пределы доверительной границы, что свидетельствует об отсутствии каких- либо мембранных нарушений эритроцитов у данного больного.

В табл. 1 приведены статистические данные критерия устойчивости эритроцитов к ДУ для двух групп лиц. В одну группу входят практически здоровые люди, в другую - пациенты с клиническим диагнозом: ИБС, атеросклероз аорты и коронарных сосудов.

Из табл. 1 следует, что доверительные интервалы для обеих исследованных групп с вероятностью 99% не перекрываются между собой, т.е. предложенный способ позволяет надежно определять мембранные нарушения эритроцитов больных атеросклерозом.

Поскольку вывод о таких нарушениях делают на основании сравнения критерия ДУ, полученного для индивидуального пациента со средним значейием критерия ДУ, характерным для нормы, то доверительная граница для нормы определяется с учетом односторонней оценки по формуле

- норм +

нор

де ДУиорд,- доверительная граница

значений критерия ДУ, соответствующих норме; t0-H - нормированное отклонение при односторонней оценке (teen t ПРИ удвоенном значении уровня значимости) ;

& - среднеквадратическое отклонение;

876

ЗГ - среднее значение критерия ДУ для выборки практически здоровых людей. Подставив значения х, t 0,н (при уровне значимости 0,05) и & , взятые из табл. 1 для группы практически здоровых лиц, получают ДУНЧ0 °аёО,237+ + 1,64 «0,115 0,43. Таким образом, получив значение критерия ДУ устойчивости эритроцитов к дигитонину, превышающее величину 0,43 с вероятностью 95%, определяют мембранные нарушения эритроцитов при

атеросклерозе.

В табл. 2 представлены данные о специфичности предложенного способа в сравнении с известным при выявлении изменений мембран эритроцитов при

различных заболеваниях, сопровождающихся нарушением липидного обмена. Предложенный способ имеет высокую специфичность по отношению к изменениям мембран эритроцитов, вызванным

именно атеросклерозом, практически не выявляет изменений при других нарушениях липидного обмена и обладает в 4,4 раза более высокой точностью по выявлению лиц с изменением мембран

эритроцитой при атеросклерозе, чем известный.

Формула изобретения

Способ определения мембранных нарушений эритроцитов при атеросклерозе путем определения структурного состояния мембран эритроцитов, отличающийся тем, что, с целью повыше-, ния точности способа, проводят последовательную фильтрацию крови через мелкопористый фильтр с нарастающими до 5 мкмоль концентрациями дигитони- на, измеряют оптическую плотность фильтрата при длине волны 410 нм,

определяют распределение эритроцитов по устойчивости к дигитонину, затем рассчитывают соотношение величин оптической плотности фильтрата, полученных при концентрации дигитонина

3 мкмоль и при концентрации дигито- нина, вызывающей максимальный гемолиз, и при значении его 0,43 и более определяют мембранные нарушения эритроцитов при атеросклерозе.

Практически здоровые люди (норма) 30 0,2370,0210,115 0,184-0,290 Вольные атеросклерозом30 0,4330,0290,160 0,359-0,507

п - количество обследованных лиц; х - среднее значение критерия ДУ; S-jr - ошибка среднейj С S- - среднеквадратичное отклонение; П| - среднее значение генеральной совокупности; t - нормированное отклонение. ЛПри уровне значимости 0,01 t 2,54.

Изобретение относится к кардиологии. Целью изобретения является повышение точности способа. Для этого венозную кровь с антикоагулянтом разводят физиологическим раствором, полученную суспензию наносят на стекловолокнистый фильтр, расположенный в термостатируемой при 37° ячейке, отсасывают водоструйным насосом и однократно промывают физиологическим раствором. После этого на фильтр с промытыми эритроцитами поочередно наливают порцию физиологического раствора с дигитонином возрастающей концентрации от 0 до 5 мкмоль с шагом 0,5 мкмоль, отсасывая каждую порцию гемолизата в отдельную пробирку. Содержимое пробирок фотометрируют при 410 нм на спектрофотометре. По данным фотометрирования строят для каждой порции зависимость количества вышедшего из эритроцитов гемоглобина от концентрации дигитонина в этой порции. За критерий, характеризующий распределение эритроцитов по устойчивости к дигитонину, принимают отношение оптической плотности при концентрации дигитонина 3 мкмоль к оптической плотности в максимуме распределения. При значении критерия, превышающем величину 0,43, определяют мембранные нарушения эритроцитов при атеросклерозе. Изобретение позволяет добиться более высокой специфичности и точности (в 4,4 раза) определения мембранных нарушений при атеросклерозе. 1 ил., 2 табл.

117371 2

47

2,1

175023,84

3352,825,18

32 31,42

63 3,11,55

Примечание. Специфичность определяется как отношение доли лиц с положительной реакцией в опытной (патология) к доле лиц с положительной реакцией в контрольной (здоровые) группах.

Таблица 2

46 30 62

31 60

4,2

11,8 2,8

11,4 2,7

6,1 7,7

М 1,8

Редактор А. Козориз

Составитель В. Гудошников

Техред М.Дидык Корректор Э.Лончакова

Заказ 2602/46

Тираж 790

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат Патент, г.Ужгород, ул. Гагарина,101

мкМ

Подписное