Способ количественного определения стероидных гормонов Советский патент 1989 года по МПК G01N33/68 

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения стероидных гормонов, и может найти применение в медицине, сельском хозяйстве и экспериментальной биологии.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что в качестве гормонсвязывающего вещества используют специфический ре- цепторный белок к стероидным гормонам, получаемый из децидуальной ткани, а для разделения связанных и не- связанньк гормонов используют гидро- ксилапатит.

Этот белок обеспечивает связьшание гормона с высокой константой связывания .(константа диссоциации Кд ), т.е. более специфическое связывание, чем связывание гормона с антителами (K 10 M) зтого гормона.

Способ осуществляют следующим образом.

Пример 1. Получение специфического рецепторного белка к прогестерону.

Специфический рецепторный белок к прогестерону получали из децидуальной ткани человека следующим образом.

К 1 г ткани, отмытой от крови физраствором (при 4°С) и гомогенизированной в проточном гомогенизаторе

со о о: ел

АПГ-1, добавляли 5 мл ледяного буфера рН 7,4, содержащего 10 мМ ТРИС-ИС1, 1,5 мМ ЭДТА и 0,02% азида Na. Полученную массу осаждали при ЮЗОООд в течение 1 ч, осадок отбрасывали и в дальнейшем использовали супернатант, содержащий 4,5 мг белка/мл.

Полученный супернатант обрабатывали в течение 1 ч при О С свежеприготовленным раствором трипсина (8 мг/мл 1 мМ НС1) из расчета 20 мк трипсина на 1 мг белка и затем соевым ингибитором трипсина из расчета 2 мкг ингибитора на 1 мг трипсина (для прекращения пщролиза) .

В полученный гидролизат добавлял меркаптоэтанол до концентрации 1 мМ и -затем при О С насыщенный раствор сульфата аммония (в 1 мМ ЭД и 1 мМ меркаптоэтанола) до 20% по объему. Эту смесь в течение 40 мин размешивали на магнитной мешалке для формирования белкового осадка, и центрифугировали 15 мин при lOOOg Осадок отбрасывали, а к супернатант добавляли насьщенный раствор сульфата аммония в ЭДТА и меркаптоэтано ле до 40% концентрации по объему.

Белковый осадок из этой смеси фомировали на магнитной мешалке и осадали- центрифугированием. Надосадоч- ную жидкость отбрасывали.

Полученный осадок растворяли в буфере, содержащем 10 мМ трис-НС1 (рН 7,4), 1,5 мМ ЭДТАи 1 ( меркаптэтанола (ТЭМ). Специфический рецепт ный белок к прогестерону выделяли

5

5

наносили около 80 мг белка, сила тока составляла 5 мА/см геля, скорость элюции 15 мл/ч. Время разделения

(выход фракции с необходимым рецеп- торным белком) не превьпиало 22 ч.

После изотахофореза препараты, содержащие специфический рецепторный белок к прогестерону, концентрирова0 ли через мембранный фильтр Амикон и наносили на колонку (16x31 мм с охлаждением) с ДЕАЕ целлюлозой (ДЕ-52 Whatman), уравновещивали ТЭМ буфе- . ром. Ионно-обменную хроматографию проводили ступенчатой элюцией ТЭМ буфером и ТЭМ буфером, содержащим 0,15 М КС1. В белковый раствор, элюированный в присутствии КС1, при О С добавляли нейтральный формалин до концентрации 0,5% и через 45 мин выделенный белок концентрировали на мембранном фильтре Амикон (для удаления триса и НС1) и лиофилизиро- вали. Лиофилиэированные препараты белков-рецепторов к прогестерону хранили в холодильнике и использовали для определения прогестерона в биологических жидкостях и тканях,

Кажду партию лиофилизированного препарата специфического рецепторно- го белка к прогестерону (СРВ) проверяли на титр связывания прогестероном, меченым люминолом (ПЛ). Для этого навеску сухого СРВ растворяли в 0,1 М натрий-фосфатном буфере рН 7,5, содержащем 1 мМ ЭДТА и 0,1% азида натрия (НЭА буфер), и титровали со 100 мкл ГШ. Концентрацию СРВ, связывающую 50% гормона в пробе с 500 пг

0

5

0

Изобретение относится к биохимии и может найти применение в медицине, сельском хозяйстве, экспериментальной биологии. С целью повышения точности анализа исследуемый образец обрабатывают специфическим рецепторным белком (СРБ) к стероидным гормонам (СГ) в присутствии стероидных гормонов, меченых люминесцирующим веществом (СГЛ). Затем с помощью гидроксилапатита отделяют СГ и СГЛ, связавшиеся с СРБ. О количестве СГ в исследуемом образце судят по интенсивности люминесценции в фазе, содержащей СГ и СГЛ, связанные с СРБ. Для осуществления способа используют СРБ к СГ, выделенный из децидуальной ткани. 1 табл.

из этого раствора путем гель-фильтра- 40 ГШ использовали в дальнейших аналиции на колонке (1100 х 20 мм с охлаждением) с сефадексом Г-150. Фракции, содержащие специфический рецепторный белок к прогестерону (присутзах как рабочую концентрацию.

П р и М е р 2. Определение содержания прогестерона в сыворотке крови

Для исследования брали образцы сыствие этого белка определяли с помо- д5 воротки крови трех женщин (16 недель

беременности) объемом по 0,5 мл, которые охлаждали до 4 С, и из каждого образца отбирали по 100 мкл в инкубационные пробирки для последующего анализа.

щью бпособа рецепторно-люминесцент- ного анализа) собирали, концентрировали через мембранный фильтр Амикон и дальнейшую очистку проводили методом изотахофореза в колонке 200х X 20 мм с охлаждением в полиакрил- амидном геле (,2%, ), содержащем 8М мочевину, 60 мкл амфолинов (рН 6-8) на 1 мг белка. Ведущим буфером был трис-фосфатный (рн 6,6), замыкающим электролитом - трис-Б - -амушокапроновый (рН 8,9), элюцион- ным буфером - ведущий буфер, содержащий 1 мМ меркаптозтанола. На колонку

зах как рабочую концентрацию.

П р и М е р 2. Определение содержания прогестерона в сыворотке крови.

Для исследования брали образцы сыворотки крови трех женщин (16 недель

беременности) объемом по 0,5 мл, которые охлаждали до 4 С, и из каждого образца отбирали по 100 мкл в инкубационные пробирки для последующего анализа.

Для построения калибровочной кривой готовили контрольные образцы, содержащие 100, 200, 500, 1000, 2000, 5000 и 10000 пг (пикограмм/мл) прогестерона, по 100 мкл которых также отбирали в инкубационные пробирки.

В отобранные исследуемые и контрольные пробы добавляли по 100 мкл раствора прогестерона, меченого люкик

НОЛОМ (ПЛ), содержащего 500 пг/мл ПЛ, и по 100 мкг раствора, содержащего специфический рецепторный белок к прогестерону ( выделенный из дециду альной ткани, как описано в примере 1) в количестве 1,1 мг/мл, обеспечивающем связывание 50% ПЛ в пробе, содержащей 500 пг ПЛ (см.пример 1).

Полученные смеси инкубировали при А°С и встряхивании в течение 60 мин (во время инкубации происходи образование комплекса прогестерон- рецепторный белок).

Для отделения прогестерон-рецеп- тоного комплекса от свободного прогестерона и остальных компонентов сыворотки крови в каждую проинкубированную пробу добавляли гидроксилап тит в количестве 30 мкг и выдерживали при 4 С в течение 10 мин. Проинкубированные пробы - гидроксилапа- тит с прогестерон-рецепторным комплексом - наносили на фильтры (каждую на 1 фильтр) и промывали холодным НЭА буфером (0,1 М натрий-фосфатный буфер рН 7,5, содержащий 1 мМ ЭДТА и 0,1% азида натрия). Затем каждую пробу переносили (вместе с

Сравнительная характеристика специфичности и чувствительности способов РИА и РЯА при определении прогестерона

8 8

Содержание прогестерона в сыворотке крови определяли методами РИА и РЛА у 8 женщин, имеющих 9 недель беременности, и у 8 женщин, имеющих ,16 недель беременности.

В каждый флакон добавляли по 10 мкл 5 М NaOH и инкубировали при 60 С 60 мин. Пробы охлаждали до комнатной температуры, отбирали из них для дальнейшего исследования по 300 мкл жидкости, добавляли в каждую

5

0

фильтром) в отдельный флакон и заливали НЭА буфером (по 200 мкл в каждую пробу).

Для отделения изолюминола от прогеетерои-репепторного комплекса к пробам добавляли по 100 мкл 5 М NaOH и инкубировали при 60 С 60 мин.

Q Пробы охлаждали до комнатной температуры, отбирали по 300 мкл (пипеткой с фильтром) и помещали их в кюветы люминометра.

Затем в пробы добавляли до 100 мкл раствора пероксидазы хрена и не позже чем через 30 с вносили по 100 мкл 10 м .

Интенсивность хемолюминесценции измеряли в люминометре в течение 20 с и полученные значения использовали для построения калибровочной кривой (зависимость интенсивности люминесценции от концентрации прогестерона в контрольных пробах) и

5 определения количества прогестерона в пробах сыворотки крови обследуемых женщин.

Минимальное количество прогестерона, определяемое в стандартных про0 бах различными способами, представлено в таблице.

0,l6i:0,008

23,,96 39,62i1,79

исследуемую пробу по 100 мкл пероксидазы хрена и 10 м сразу же измеряли в люминометре интенсивность люминесценции каждой из проб за период 20 с.

Из таблицы видно, что при количе- ственном определении прогестерона в стандартных растворах точность, а следовательно, и специфичность РЛА и РИА почти одинаковы. Однако, при определении гормона в сыворотке крови беременных женщин (различных сроков беременности) специфичность РЛА более, чем в 2 раза выше специфичности РИА.

Формула изобретения

Способ количественного определения стероидных гормонов путем обработки сыворотки крови гормонсвязываю- щим веществом в присутствии меченых

стероидных гормонов, удаление свободных гормонов с последующим определением количества метки во фракции связанных с антителами гормонов, отличающийся тем, что, с целью повьщ1ения точности способа, в качестве гормонсвязывающего вещества используют рецепторнын белок из децидуальной ткани, а для удаления свободных гормонов используют гид- роксилапатит.