Белковая смесь для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях и способ ее получения Советский патент 1984 года по МПК C07K1/22 A61K38/02 C07K2/00 C07K14/435 C07K1/16 C07K14/78 A61K38/39 

f-f

/ .

a.s

л-1

1

1, Белковая смесь, содержавшая ..ilift и у г глобулины при следуютем соотношении компонентов, мае.%: ,-глобулин 30-40 ft -глобулин 40-50 f -глобулиц 10-20 для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях. (Л

IV f/fHMfff

«

« 2. Способ получения белковой смеси по п. 1,отличающиеся тем, что лишеннук эндогенных стерок- дов сыворотку ретроплацентарной крови .человека смешивают с биоспецифическим сорбентом, содержа&шм конъюгироваиный кортиэол с концентрацией кортизола в полученной суспензии 5-10 - 7 10 моль/л, инкубирук1Т в течение 6-12 ч при переманивании, сорбент промьавают при

Изобретение относится к новой белковой смеси для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях, которая мсжет найти применение в медицине и биохимических исследованиях и к способу ее получе ния.

Известна белковая смесь, содержа щая /5-глобулин 1, , .

Этот белок связывает андрогены и эстрогены в мольном соотнслиении белок: стероид 1:1 с очень высокими константами ассоциации : 10 М (специфически связывающий Оелок). Кроме (Ь-глобулина в состав смеси входят альбумин и другие белки. Альбумин связывает андрЪгёны, экстрогену, кортикостероиды и прогестины в мольном соотисмлении белок: стероид 1: ;п( п 1) с низкой константой ассоциации; 10 М (неспецифически связывающий белок). Количественное содержание компонентов белковой смеси не приводится.

Недостатком этой смеси является то, что хотя такая белковая смесь потенциально может быть применена для анализа андрогенов и экстрогенов, однако она не обладает специфической связывающей способностью по о.тнсиению к кортикостероидам и прогестинам и не может быть использована для их количественного определения. Кроме того, присутствие альбумина в известной смеси снижает специфичность и чувствительность анализа андрогенов и эстрогенов.

Такую белковую смесь получают путем обработки сыворотки нормальной крови человека последовательно этиловым спиртом и сульфатом полученную при этом белковую фракцию, лишенную эндогенных стероидов, перемешивают с биоспецифическим сорбентом в течение 2 ч при . В качестве биоспецифического сорбента применяют продукт последовательного присоединения азодианилина и 3-гемисукцината андростандиола к активированной эпихлоргидрином сефаро зе 4 В.

Смесь переносят в колонку- и откывают от балластных белков 0,05 М трис-HCl буфером, рН 7,5, 1 М по NaCl при . Виоспецифически адсорбированные белки элюируют при с после гидролиза азосвязи дитионитом натрия в 0,3 М трис-HCl буфеO Р® Р содержащем дигидротестостерон. Для стабилизации /3 -глобулина во все промыва1дщие и элюирующие буферы вводят нрны Са.

Известна белковая смесь 2, обос гашенная oi -глобулином, специфически связывающим кортикостероидные и составляющим 20-50% от общего содержания белка. Другие белки смеси охарактеризованы как у-глобулины и альбумин.

0 Недостаток этой белковой смеси состоит в том, что хотя такая белко- вая смесь потенциально мсжет быть применена для анализа кортикостёроидов и прогестинов, однако она не

5 обладает связывающей способностью по отношению к андрогенам и эстро- генам и не может быть использована для их количественного определения. Присутствующий в этой смеси альбумин снижает специфичность и чувствительность анализа прогестинов.

Способ получения такой белковой

смеси состоит в том, что сыворотку

нормальной крови доноров, лишенную

5 эндогенных стероидов, перемешивают с биоспецифическим сорбентом в течение 1,5 ч при 4°С. Сорбент представляет собой продукт последовательного присоединения 3,3-диаминодипропилQ амина и 21-гемисукцината кортизола к активированной бромцианом сефарозе 4В. .Смесь переносят в колонку и отмывают от балластных белков при сначала 0,05 М натрийфосфатным буфером, рН 7,0, 0,2 М по NaCl, затем 0,001 М натрийфосфатным буфером, рН 7,0. Виоспецифически адсорбированные белки элюируют при 25°С раствосолевым раствором и элюируют при 30-40 С компоненты белковой смеси раствором кортизола в трис-НС1 буфере, содержащем ионы кальция. 3. Способ по п. 2, отличающийся тем, что в качестве био,специфического сорбента используют продукт последовательного присоединения 1,6-диаминогексана и 21-гёкнсукцината кортизола к активированной эпихлоргидрином агарозе. ром кортиэола (200 мкг/гдп) в 0,05 М натрийфосфатном буфере, рН 6,5, 0,1 М по NaCl. Известные способы выделения белковых смесей, связывающих стероидные гормоны, позволяют получить бел ковые смеси, содержащие или только или только -глобулины, o6: iaдающие специфическим СБЯзыванием. Кроме того, способы предусматривают ,-две раздельные процедуры синтеза аффинных- сорбентов, включают две последовательностк неодинакозых one раций, пpoвoдиJv ыx раздельно к требующих поэтому вдвое больших затрат сыворотки и реактивов. Таким образом, очевидна неэкономичность промышленного освоения известных способов полученил белковых смесей для целей клинического анализа . ко.р-нкостероидов, прогестннов, андрогелоз и эстрогенов. Цель изобрет ьшя - белкозая гмес нового состава/связывающая к:.|.-тихостероиды,прогестинЫ(.андроген1 г- э:т рогены, и способ ее получения.. Предлагается белковая смесь, содержащая cL, fir- и J- -глобулины при следующем соотношении комдокактов, вес,%; ci- -глобулин 30-40 /} -глобулин 40-50 j- -глобулин 10-20 Предлагается также для связывания стероидных гормонов в биологических жидкостях способ получения такой белковой смеск; заключающийся к том что лишенную эндогенных стероидов сыворотку ретроплапентарной крови человека смешиБа.2от с биоспацифичесКИМ сорбентом, содержащим конъюгиро ванный кортизол с концентрацией кор тизола в полученной суспензии 710 моль/л,инкубируют при 28 с в течение 6-12 ч при переме1Ш1за ; НИИ,сорбент прогллвают при 2-8С со левым раствором и эл оирушт при 3040°С ко ;шоиенты белковой смеск раст вором кортизола Е тркс-НС.1 буфере с держащем ионы кальция о иред51Очтитзл.ьным вариантом спосо ба являетсн применение в качестве биоспецифическогс сорбента проду2.:та последовательного присоединения 1,6-дкамииогексана и 21-гемисукцина та кортизола и активированной эга: заюрхидрино. сахарозе. Белковая смесь может быть получе на или в виде водного раствора {кон центрация белка 40 мг/глл) ,- или пос ле лиофильной сушки водного раствора в виде сухого зетцества, Выбор источника сырья для выделе ния белковой смеси обусловлен, воiпервых, доступностью и низкой стоимостью ретроплацентарной крови по .сравнению с нормальной кровью доноров, во-первых, тем, что ретроплацентарна.я кровь содержит значительно больщее количество стероидсвязывающих о.-глобулина и /3 -глобулина .3 по сравнению с нормальной кровью. Указанные выше концентрации конъю|гированного кортизола на матрице и соотношение объемов аффинного сорбейта и сыворотки подбираются эмпирически с целью избирательной адсорб-ции отероидськзывэлощих cL к /}-гло б5линов. Более продолжительное по сравнению с аналогнчньи - способами перемешивание .сьшоротки с сорбентом позЕоляет исключить адсорбцию альбу s-;нг на аффинной матрице. Фосфатный буфер и трис-НС буфер, содержащий , равноэффективны при прог 5ызке колонки О балластных белков, ТрисHCi буфер, содержаашй , стабилизкрзат стероидсвязывающие свойства ,5-глобулина в процессе выделения и itpH последующем хранении белковой смеем «Применяемые в пре;;лагаемом способе условия элюции биоспецифически адсорбированных на кортизолсефарозе белков (температура,концентрация кортизо.яа в буфере) обеспечивают полную десорбцию комаонентОБ предлагаемой белковой смеси. Пример 1. Получение белковой смеси. Перед стаидаей аффинной хроматографии из сыворотки ретроплацентггрной кровм удггляют эндогенные стероиды. Затем к 5 л лишенной эндогенных стероидов сыворотки прибавляют 100 мл геля содбента, содержащего 1 мкмоль конъюгированного кортизола н 1 упло некного геля, что создает кояцектращию кортизола во в.сем объеме суспензии 2-10 моль/л .Иолуч.енную суспензию- перемешивают .при 4°С в течение 8 ч. Аффинный сор- бент отделяют путем фильтрования -суспензии на пористом стеклянном фильтре, и npohuJsaKiT 1 л охлажденного до i°C 0,05 М трис-НС1 буфера рН 3,0, Oj5 .М по NaCl и 0,05 М по CaCl, (стандартный буфер). Гель переносят в колонку с пористым стеклянным оильтром ;:. продолжают отмывку от балластных белков при 4 С 0,5 л того же буфера. Затем через колонку пропускают при 4 С 70 мл стандартного буфера, содержащего 400 кортаэола (для полного растворения с-эроида в буфер добавляют 4% метано.) . Д.ля десорбции белков теь-шературу колонки повышают до .37 С и вьщер) в этом режиме в течение 1 ч. Белки элюируют 70 мл стандартного -буфера, содержащего кортизол. Общее количество белка в элюате составляет 280 мг. Увеличение объема сыворотки вплоть до 9 л приводит к увеличению выхода б&пковой

смеси до 350 мг. При перемешивании суспензии в течение 6 ч выход белковой смеси равен 220 мг, а в течение 12 ч - 310 мг. Замена стандартного буфера на 0,05 М натрийфосфатный буфер, рН 8,0, рнижает выход до 260 мг. При концентрации конъюгированного кортиэола 0,5 мкмоль на 1. мл уплотненного геля биоспецифического сорбента получают 190 мг белковой ;смеаи, 2,0 мкмоль - 290 мг.

Пример2. Качественный и ко:личественный состав белковой смеси.

Качественный состав белковой- смеси определяют с помощью электрофоре;за в 7,5%-ном полиакриламидном геле, :измеряя относительные электрофорети:ческие подвижности(Rf) компонентов (смеси. Получение величины сравнива;ют с эталонными значениями Rf и от|носят компоненты смеси к опред:; злен ным классам белков. Количественный состав белковой смеси определяют :посредством элюции из геля ком понентов смеси, разделенных электрофоретически, и проведения количественного анализа белков. Электрофорез njpo:водят после нанесения 200 мкг белковой смеси, выделенной в соответст:вии с примером 1, на каждую трубочку :геля. Белковые зоны одной из трубочек окрашивают к проводят качествен:ное определение компонентов белко;вой смеси. Соответствующие зоны дру;гой неокрашенной трубочки вырезают ;и элюируют белки трис-НС1 буфером. Затем в элюатах проводят количественное определение белка. Качественный состав предлагаемой белковой смеси приведен на чертеже. Хорошо разделенные компоненты смеси имеют ,614 0,401; 0,293 и относятся к tf ft г Т -глобулинам соответственно. Как видно из чертежа, на электрофрреграмме отсутствует компонент с подвижностью,соответствующей альбумину человека талонное значение Ff 0,71

Количественный состав предлагаемой белковой смеси приведен в табл.1 Эта таблица содержит данные по количественному определению компонентов белковой смеси, полученной в результате 8 независимых выделений. Содержание каждого компонента выражено в мас.% от их суммарного количества. Выделение: 1-белковую смесь получают, как в примере 1, II - объем сыворотки 3 л; III - объем сыворотки 9л; 1У - перемешивание суспензии длится 6 ч; V - перемешивание суспензии длится 12 ч; У1 - концентрация конъюгированного кортизола fO,5 мкмоль/мл уплотненного геля; УП - концентрация конъюгированного кортизола 2,0 мкмоль/мл;УШ - стандартный буфер заменяют 0,05 М натрийфосфатный буфер, рН 8,0.

Пример 3. Связывание стероидных гормоноа белковой смесью. Стероид ев язывакядие свойства предлагаемой белковой смеси выявляют методами электрофореза в полиакриламидS ном геле и равновесного диализа белковой смеси в присутствии стероидных гормонов.

А. Электрофорез в полиакриламидном геле о Электрофорез в полиакрил10 амидном геле надежно разделяет

свободный и связанный с белком стероиды вследствие того, что электронейтральный свободный стероид остается на старте, а связанный стероид

5 переносится с белком. После проведения электрофореза связанный стероид, локализуется на участке геля, соответствующем полосе белка-носителя. Из раствора белковой смеси

0 полностью удаляют кортизол, внесенный в процессе ее выделения. Для этого используют твердофазную адсорбцию стероида при 37-С в течение 30 мин на 2%-ной суспензии декстран5 покрытого активированного угля. Белковую смесь, лишенную стероида, делят на 6 проб по 100 мкг.. в пройл вносят и уравновешивают tSO мин, 25С) радиоактивные и холодные стероиды-тестостерон(Т) и кортизол

(F). Весовым вкладом радиоактивных 1,2-3Н -кортизола (Г) и 1,2-% тестостерона (Т) пренебрегают. Проба, содержит только - ,5 мкг Р; III - 0,5 мкг Т;

5 1у - У - Т + 0,5 мкг Т; У1 - 0,5 мкг J. Количество радиоактивности, внесенное во все пробы, одинако-, во.

0 Электрофорез проводят, как в примере 2, но при для уменьшения диссоциации комплекса белок-стероид. После электрофореза трубочки геля разрезают на участки длиной 2 мм, измеряют их радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике и соотносят с окрашенными белковы- , ми зонами на неразрезанных трубочках. Результаты электрофореза системы белковая смесь - стероид отражены на графиках, и.зображенных на чертеже. Номер кривой на графиках соответствует номеру пробы белковой смеси, содержащей определенную (см. выше) комбинацию стероидов. Из графических построений видно, что следовые количества кортизола (кривая 1) связываются только с о -глобулином, а следовые KOjiH ecTBa тестостерона (кривая 1У) связываются только с

0 р-глобулином. При больших количествах F и Т в пробах (И, У) наблюдается значительное уменьшение связанной радиоактивности и, следовательно, уменьшение процента связанного

5 стероида. Этот факт характеризует

I, - и -глобулины как специфически связывающие белки. Большие количества Т практически не влияют на уровень связанной радиоактивности F (ZIZ) . В свою очередь, большие количества F мало влияют на уровень связанной радиоактивности Т (У1). Хотя электрофоретический анализ дает лишь полуколичественную характеристику стероидсвязывакидих свойств предлагаемся белковой смеси, тем не менее он наглядно демсмстрирует стероидсвязывающую aвтoнo в ocть оС,,- и /ь -глобулинов по отнснпению к кортизолу и тестостерону и специфичность связывания этих гормонов.

Б Равновесный диализ. Система белковая смесь-стероид при равновесном диализе приходит в состояние термодинамического равновесия. Присутствие радиоактивного стероида в системе дает возможность определять, отношение концентраций связанного (8) и несвязанного (U) белкокой смесью стероидов. Величина &fii пропорциональна константе ассоциации комплекса стероид - белок и является критерием количественной оценки связывания различных стероидов с белковой смесью.

Из раствора белковой смеси удаляют кортизол, внесенный в процессе шаделения (см. пример ЗА).

Раствор белковой смеси (100 мкг/ мл) делят на 15 проб по 1 мл и переносят в отдельные диализные меиочки (внутренний раствор диализной систеки). Мешочек помоцают в сосуд с 12 мл стандартного буфера (вГнеаинййГраствср) , содержащего радиоактивный и холодный стероиды в следующих комбинациях. Внешний раствор диализной системы 1 содержит радиоактивный кортизол (F); 11 радиоактивный тестостерон (Т); 111 - 0,25 мкг кортизола; 1У Т + 0,25 мкг тестостерона; У - 0,25 мкг тестостерона; У1 - 0,25 мкг кортизола; У11 - 0,25 мкг кортикостерона; УШ 0,25 мкг п-дезоксикортизола; IX 0,25 мкг и-дезоксикортикостерона; X - 0,25 мкг кортизона; XI 0,25 мкг альдостерона; XII - 0,25 мкг прогестерона; ХШ - 0,25 мкг 17о(-оксипрогестерона; Х1У Т 0,25 кг дигидротестостерона, КУ - Т + 0,25 мкг зстрадиола.

Внешние растворы дигшизных систем перемешивают при 4 С в течение 48 ч. Затем отбирают по 0,5 мл внутреннего и внешнего раствора, измеряют радиоактивность на жидкостном сцинтилляционном счетчике и рассчитывают

величину В/и. „

Результаты равновесного диализа систем белковая смесь-стероид: в диализных системах 1-ХУ составляет

5S76; 31,4; 16,6; 15,6; 37,2; 29,6; l5,4j 14,0; 15,1; 25,4; 23,G;18,2-, ,20,6; 11,2; 16,3 соответственно.

Как видно из приведенных данных в диализных системах УП-ХШ величина радиоактивного кортизола значительно ниже, чем в системе 1, не содержащей холодного стероида. Таким , стероидные гормоны в системах У11-ХШ, как и холодный кортизол (ЮГ/ обладают способностью радиоактивный кортизол в его комплексе с белковой смесью. Поскольку радиоактивный кортизол связан в белковой смеси с оС(-глобулином, то стероиды УГ1-ХШ также свя5зываются с этим белкой и константа связывания стероида тем больше, чем сильнее он понижает B/U. На основании приведенных данных для ксч тикостероидов и прогестинов можно соста0вить следующую последовательность возрастания их сродства к белковой смеси; ксчртизон (X) альдостерон (XI) 17-оксипрогестерон (ХШ) прогестерон (ХП) кортизол (Ш) : норти5костерОн (УП) п-дезоксикортикостерон (IX) п-дезоксикортизол (УШ). Стероидные гормоны в системах Х1У и ХУ, как и холодный тестостерон, обладают способностью заме0щать радиоактивный тестостерон в его комплексах с белковой смесью. Поскольку рещиоактивный тестостерон связан в белковой смеси с -глобулином (см. пример ЗА), то стероиды

5 Х1У и ХУ также связываются с этим белком. Последовательность возрастания сродства андрогенов и зкстрогенов к белковой смеси выглядит так:

эстрадиол (ХУ) тестостерон (1У)

0 дигидротестостерон (Х1У).

Холодный тестостерон практически не конкурирует с радиоактивным кортизолом за связывание с белковой смесью (система У). Из зтого

5 следует/ что кортикостероидьл или прогестины способны связываться с белковой смесью, которая уже содер-/жит связанные андрогены и/или эстрогены. .

Холодный кортизол практичес0ки не конкурирует с радиоактивным тестостероном за связывание с белковой смесью (система У1) . Следова.тельно, антрогены или эстрогены способны связываться с белковой смесью,

5 которая уже содержит связанные кортикостероиды и/или прогестины.

Природные белковые смеси (например, сыворотка крови), в которых совместно присутствуют стероидсаязы0вающие оС. и /i -глобулины, не обладают способностью специфически и автономно связывать стероидные гормоны, подобно предлагаемой белковой смеси. Это обусловлено большой разницей в количествах d.- и у5 -глобулинов в

5

природной смеси и присутствии альбумина.

В. Стабилизирующее действие у глобулина на стероидсвязывающие e4jи /S -глобулины.

О стабилизирующем действии i глобулина судят из сравнения стероидсвязывающиА свойств предлагаемой белковой смеси и свойств компонентов смеси после электрофоретическог отделения j -глобулина, С этой целью проводят электрофорез двух одинаковых проб по 100 мкг белковой смси в двух трубочках полиакриламидного геля (см. пример .ЗА) . Компоненты смеси элюируют в одной из трубочек совместно (контрольная проба) , а В другой трубочке раздельно, получая фракцию oi- - и /i -глобулинов (опытная проба) и фракцию j -глобулина „ Из опытной и контрольной проб удаляют связанный кортизол в соответстви с примером ЗА, Затем проводят сравнительное изучение воздействия некоторых внешних факторов на связывающие свойства oi. - и /i-глобулинов в присутствии (контроль) и отсутствии (опыт) j-глобулина. Методом изучения служит равновесный диализ проб в присутствии стероида. Используют диализные систекы Ш и 1У,, пример ЗБ. Результаты эксперимента приведены в табл, 2. Стандартными условиями были условия равновесного диализа в примере ЗБ. Температурные воздействия продолжались 15 мин, а затем пробы охлаждались до 4°С.

Из видно, что при обычно применяемых в работе со стероидсвязывающими белками воздействия отношение 6/и для связывания как тестостерон а j. так и кортизола уменьшается более существенно в случае отсутствия у-глобулина в белковой омеси (опытная проба) . При неизме нной константе ассоциации уменьшение В/и отражает уменьшение количества с :ероидсвязывающих центров смеси, Снижение количества связывающих центров можно объяснить, или уменьшен нием числа стероидовязывающих компонентов в пробе за счет удаления у-глобулина, или частичной ина.ктянацией смеси без у-глобулина Из результатов равновесного диализг. фракции, содержащей только -у глое1ули1, следует, что он практически не обла дает стероидсвязывающей способностью (В/и для кортизола Og2f тестостерона ), Аналогичные данные получены при .электрофорезе (см, пркмар

ЗА), Таким образом, j--глобулин стабилизирует стероидсвязывающие компоненты предлагаемой белковой смеси

Основное преимущество предлагаемой белковой смеси заключается в той что она обладает высокой стероид-связывающей емкостью и содержит только полезные компоненты с точки зрения связывания стероидных гормонов; о4,- и fb -глобулины специфически и автономно связывают стероиды различных классов, а -глобулин стабилизирует стероидовязывшощую активность смеси. Каждая из двух известных белковых смесей содержит только один полезный стероидовязывающий компонент наряду с балластными к неспецифкчески связывающиг-ш белками.

Пpeи yщecтвa предлагаемой белковой смеси обеспечивают ей гораздо более широкое практическое применение по сравнению с аналогами. Предлагаемая смесь может применяться как универсальная и высокочувствительная стероидсвязывающая система в конкурентном белково-связывающем анализе стероидных гормонов. Высокая связывающая емкость белковой смеси позволяет применять ее для эффективного извлечения и концентрирования стероидов из растворов биохимических гфоизводств и би.ологических жидкостей,

Предло.;гаемый способ получения белковой смеси предусматривает минимальное число операций, которые обеспечивают сов.местное выделение : -5и ,-глобулинов и стабилизирующего их -глобулина. Эмпирически найденные оптимальные параметры; соотношение объемов сыворотки крови .и аффинного сорбента и концентрация конъюнгированного кортизола на матрице опреде.ляют избирательную адсорбцию стеРоидсвязыБающих коглпонентоз и высокий выход смеси. Более гфодолжительнее по сразнению с аналогами перемешивание сыворотки с сорбентом позволяет исключить адсорбцию альбу1ф:на на биоспецифической матрице Применяегяые в пре,цлагаемом способе условия элюции биоспецифически адсорбированных белков (температура; концентрация кортизола и состав буфера) обеспечивают полную десорбцию компонентов смеси,

ВооирсизЕОдимость спсзсоба. высокий вылод стероидсвяэывающай смеси, низкая стоимость и дост-упность сырья обеспечивакг /озмо яос-хь проилшленного освоения vaKoio оттссобаСтабилизирующее влияние -глобулина

Стаидарные условия

Температура,С

Таблица 1

16,415,6

17,1

18,2