Способ определения бензодиазепинов в сыворотке крови и среда инкубации для его осуществления Советский патент 1992 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к биологии, в частности к биологической химии, и касается способа измерения уровня бензодиазепинов в биологических жидкостях.

Изобретение может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга путем определения в крови и иных биологических жидкостях концентраций бензодиазепинов и других веществ, имеющих сродство к бензодиазе- пиновым рецепторам, в области клинико- фармакологических исследований, например для исследования фармакокине- тики лекарственных соединений из класса бензодиазепинов, установления зависимости эффектов препаратов от уровня активных форм в крови при различных путях

введения; в исследованиях по экспериментальной фармакокинетике; для скрининга новых психотропных препаратов на специфическую биологическую активность.

Целью изобретения является упрощение способа определения уровня бензодиазепинов в крови и увеличение чувствительности среды инкубации.

Цель достигается тем, что предварительную обработку образца сыворотки крови проводят с помощью добавления к образцу этилового спирта (к 20 мкл сыворотки 45 мкл спирта), смесь инкубируют 15-20 мин при комнатной температуре, далее без отделения свободного от белков образца добавляют остальные ингредиенты инкубационной смеси; в качестве радиоактивного

М

CJ

ч со

СА) 00

лиганда используют H-Ro 15-1788, антагонист бензодиазепиновых рецепторов; для работы используют трис-HCI буфер, содержащий 500 мкМ гамма-аминомасляной кислоты (ГАМ К), которая увеличивает сродство бензодиазепиновых рецепторов к агони- стам (исследуемый препарат), не изменяя сродство рецепторов к антагонистам (радиоактивный лиганд). Таким образом, достигается преимущество связывания со специфическими местами для исследуемого препарата; расчет концентраций препарата в сыворотке крови производится без построения калибровочной кривой, на основе коэффициента пересчета, определяемого по одной контрольной точке.

Используют концентрацию меченого лиганда, равную 0,3-0,4 нМ в пробе. Выбор ее обусловлен тем, что по теории ингибитор- ного анализа рецепторного связывания максимальная чувствительность наблюдается при концентрации меченого лиганда в пробе порядка 0,1-0,2 Кд (Кд - равновесная константа диссоциации меченого лиганда). Снижение концентрации ниже этих значений не имеет смысла, т.к. дальнейшего увеличения чувствительности не дает и ведет лишь к снижению счета радиоактивности, что повышает ошибку определения.

Способ осуществляется следующим образом.

В пробирке смешивают сыворотку крови с этиловым спиртом, перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 15-20 мин. После этого добавляют меченый лиганд 3H-Ro 15-1788, рецепторный материал, перемешивают и инкубируют при 0°С в течение 50-60 мин. Инкубационная смесь содержит 500 мкМ ГАМ К. Далее разделяют свободный и связанный радиоактивный лиганд с помощью фильтрации под вакуумом и просчитывают радиоактивность связанного лиганда на жидкостном сцинтилляцион- ном счетчике. Концентрацию исследуемого бензодиазепина определяют с помощью рассчитанного коэффициента пересчета, который определяют на основе контрольной точки.

Набор для осуществления способа содержит следующие компоненты: 3H-Ro 15- 1788, в качестве мембранного препарата рецептора - синаптосомальную фракцию серого вещества коры головного мозга быка, стандартную сыворотку от психически здоровых доноров без диазепама и контрольную сыворотку с концентрацией диазепама 100 нг/мл, 2 мМ раствор немеченого диазепама, навески для приготовления трис-HCI буфера, содержащего ГАМК, и буфера для промывки фильтров.

П р и м е р 1 (по прототипу).

1.Материалы и методы. Рецепторный материал: серое вещество коры больших полушарий мозга быка го5 могенизируют в 50 объемах 0,32 М сахарозы, гомогенат центрифугируют при 1000 х g 15 мин. Супернатант переливают в другую пробирку, а осадок ресуспендируют в 0,32 М сахарозе и центрифугируют в тех

0 же условиях. Объединенные супернатанты центрифугируют при 17000 х g 30 мин. Далее полученный осадок трижды промывают в 100 объемах 50 мМ трис-HCI, буфера, рН 7,4, с помощью ресуспендирования и цент5 рифугирования при 30000 х g 25 мин. Конечный осадок разводят этим же буфером до концентрации 200 мгисх. ткани/мл. Суспензию разливают на аликвоты и хранят до использования при -70°С. Характеристики

0 рецепторного материала: Kd 4,6 + 0,4 нМ, максимальное число мест связывания 20 ± 1,4

%

фмоль/мг исходной ткани для Н-диазепама. Стандарты: для измерения уровня диазепама используют сыворотку крови без

5 диазепама и сыворотки, содержащие известное количество диазепама в диапазоне концентраций от 10 до 2000 нг/мл, которые готовят путем серийных разведений под контролем весов.

0Меченый лиганд: Н-диазепам фирмы

Amersham, 81 Ки/ммоль.

2.Процедура определения. Сыворотку крови разводят дистиллированной водой в соотношении 1 : 5. К 1 мл

5 разведенной сыворотки добавляют 50 мкл перхлорной кислоты, перемешивают и центрифугируют при 1500 х g 15 мин. К 25 мкл супернатанта добавляют 375 мкл дистиллированной воды, 1 мл рецепторного матери0 ала, который перед употреблением размораживают, разводят 1 : 10 трис-HCI буфеоом, рН 7,4, и гомогенизируют, и 100 мкл3Н-диазепама (конечная концентрация в пробе ЗнМ). Содержимое пробирок пере5 мешивают и инкубируют в водяной бане при 0°С в течение 50-60 мин. Далее содержимое пробирок фильтруют через стекловолокни- стые фильтры GF/B (Whatman), фильтры промывают 2 раза по 5 мл холодным трис0 HCI буфером и помещают в сцинтилляцион- ные флаконы с сцинтилляционной жидкостью. Радиоактивность подсчитывают через 6-18 ч.

Расчет концентраций диазепама в исс5 ледуемых образцах: для каждой пробы вычисляют процент ингибирования FJ SBo/SBj - 1, где SB0 - специфическое связывание в образце с сывороткой без диазепама, SBj - специфическое связывание в

исследуемых образцах. Концентрацию диазепама определяю по калибровочной кривой на основе рассчитанного процента ин- гибирования.

П р и м е р 2 (предлагаемый способ).

1.Материалы и методы.

Рецепторный материал: серое вещество коры больших полушарий мозга быка гомогенизируют в 50 объемах 0,32 М сахарозы, гомогенат центрифугируют при 1000 х g 15 мин. Супернатант переливают в другую пробирку, а осадок ресуспендируют в 0,32 М сахарозе и центрифугируют в тех же условиях. Объединенные супернатанты центрифугируют при 17000 х g 30 мин. Далее полученный осадок трижды промывают в 100 объемах 50 мМ трис-HCI буфера, рН 7,4, с помощью ресуспендирования и центрифугирования при 30000 х g 25 мин, Конечный осадок разводят этим же буфером до концентрации 200 мг исх. ткани/мл. Суспензию разливают на аликвоты и хранят до использования при -70°С. Характеристики рецепторного материала: Kd 4,6 ± 0,4 нМ, максимальное число мест связывания 20 + 1,4 фмоль/мг исходной ткани для 3Н-диазе- мапа; Kd 2,3 ± 0,2 нМ, максимальное число мест связывания 31,2 ± 1,8 фмоль/мг исходной ткани для 3H-Ro 15-1788.

Стандарты: в работе используют стандартную сыворотку диазепама и контрольную сыворотку, содержащую 100 нг диазепама/мл. Для характеристики способа используют также сыворотки, содержащие известное количество диазепама в диапазоне концентраций от 10 до 2000 нг/мл, которые готовят путем серийных разведений под контролем весов.

Меченый лиганд: 3H-Ro 15-1788 фирмы NeN, 81 Ки/ммоль,

Все используемые реагенты (кроме сывороток) готовят на 50 мМ трис-HCI буфере, содержащем 500 мкМ ГАМ К, рН 7,4.

2.Процедура определения.

В стеклянной пробирке объемом 5 мл смешивают 20 мкл сыворотки, не содержащей диазепам, содержащей 100 нг диазепама/мл или калибровочные сыворотки, и 45 мкл этилового спирта 96% (конечная концентрация в инкубационной среде 3%). Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при комнатной температуре 15-20 мин. После этого добавляют 1 мл Н- Ro 15-1788 (конечная концентрация 0,3-0,4 нМ) и 0,5 мл мембранного препарата рецептора, который перед употреблением размораживают, разводят в 30 раз трис-HCI буфером, содержащим 500 мкМ ГАМК, и гомогенизируют. Содержимое перемешивают и инкубируют в водяной бане при 0°С 50-60

мин. По окончании инкубации пробы немедленно фильтруют через GF/B фильтры. Фильтры промывают 2 раза по 5 мл холодным трис-HCI буфером и перемешивают в сцинтилляционные флаконы с сцинтилляци- онной жидкостью. Радиоактивность проб просчитывают через 6-18 ч. Для определения неспецифического связывания в пробирки, содержащие сыворотку без 0 диазепама, вносят по 10 мкл 2 мМ раствора немеченого диазепама до добавления в них 3H-Ro 15-1788.

3. Расчет концентраций диазепама в сыворотках,

5Для каждой пробы вычисляют величину

специфического связывания как разность между пробами, не содержащими и содержащими избыток немеченого диазепама.

Для каждой пробы определяют величи- 0 ну FI:

Fi SB0/SB,- 1

где SB0 - величина специфического связывания в образце с сывороткой без диазепама;

5 SB, - величина специфического связывания в определяемом образце.

Вычисляют коэффициент пересчета К:

K Fk/100s

где Fk - величина F для контрольной сыво- 0 ротки;

100 - концентрация диазепама в этой сыворотке, нг/мл.

Определяют концентрацию диазепама в исследуемых сыворотках Ci: 5Ci F,/K.

Примерз. Аналогично примеру 2, но в качестве радиоактивного лиганда используют 3Н-диазепам в концентрации 1,0 нМ в пробе (0,2 Kd).

0 П р и м е р 4. Аналогично примеру 2, в качестве радиоактивного лиганда используют Н-флюнитразепам в концентрации 0,4 нМ в пробе (0,2 Kd).

П р и м е р 5. Аналогично примеру 2, но 5 концентрация ГАМК в инкубационной смеси равна 0; 100 кмМ; 1 мМ.

П р и м е р 6, Аналогично примеру 2, но предварительную обработку образца проводят с помощью 15; 30; 75 мкл этанола 0 (конечная концентрация в инкубационной смеси равна 1; 2; 5% соответственно).

П р и м е р 7. Аналогично примеру 2, но предварительную обработку образца проводят с помощью 7; 15; 30; 45 мкл метанола 5 (конечная концентрация в инкубационной смеси равна 0,5; 1,0; 2,0; 3,0% соответственно).

В табл,1 представлены данные по максимальной чувствительности способа (кон- ценграция диазепама, вызывающая

15%-ное ингибирование специфического связывания 3Н-лиганда) и по концентрации полуингибирования специфического связывания меченого лиганда, полученные при проведении анализа известным и предлагаемым способами. Из табл.1 видно, что при проведении анализа предложенным способом (пример 2) чувствительность метода повышается в 3,2 раза по сравнению с прототипом (пример 1). Также отметим, что 50 %-ное ингибирование связывания меченого лиганда вызывается концентрацией диазепама в предложенном способе в 5 раз меньшей, чем при проведении анализа по прототипу.

В табл. 2 представлены данные о чувствительности метода при использовании различных меченых лигандов. Как следует из таблицы, применение Н-диазепама ухудшает чувствительность метода в 2,4 раза по сравнению с предлагаемым способом. При использовании 3Н-флюнитразепама в качестве радиоактивного лиганда чувствительность метода в 1,7 раза ниже, чем при использовании H-Ro 15-1788 (предлагаемый способ). Это объясняется тем, что диа- зепам и флюнитразепам являются агонистами бензодиазепинового рецептора, поэтому в данном случае эффекта ГАМК не наблюдается, т.е. создается преимуществ для связывания исследуемого вещества, которое также является агонистом рецептора.

В табл.3 представлены данные о влиянии различных концентраций ГАМК на чувствительность метода. Так, при анализе в среде, не содержащей ГАМК, чувствительность метода падает в 1,5 раза. При концен- трации ГАМК, равной 100 мкМ, чувствительность снижена в 1,4 раза, тогда как при концентрации 1 мМ чувствительность практически такая же, как и в предлагаемом методе. Поэтому в целях экономии реактивов в работе используют концентрацию ГАМК 500 мкМ.

В табл.4 представлены данные о влиянии этилового спирта на специфическое связывание. H-Ro 15-1788, а также об инги- бировании чистой сывороткой (без диазепама) и сывороткой с концентрацией диазепама 100 нг/мл (концентрация полуингибирования) специфического связывания меченого лиганда в присутствии различных концентраций этанола. Из табл. 4 следует, что сам этанол ингибирует связывание 3H-Ro 15-1788 с дозозависимым эффектом. Однако при этом также необходимо отметить, что по мере возрастания концентрации этанола в инкубационной среде специфического связывания 3H-Ro 15-1788

чистой сывороткой значительно уменьшается, достигая 1,8-1,0% при 3-5% этанола. Подобный эффект можно объяснить тем, что при добавлении этанола к сыворотке происходит высаживание белков таким образом, что они становятся неспособными в дальнейшем связывать меченый лиганд, что является, по-видимому, причиной снижения ингибирующего действия сыворотки крови

0 на связывание меченого лиганда. Из табл.4 также видно, что по мере возрастания концентрации этанола процент ингибирования сывороткой, содержащей 100 нг диазепа- ма/мл, увеличивается, что говорит об увели5 чении чувствительности метода,

В табл.5 представлены данные о влиянии метанола на специфическое связывание 3H-R0 15-1788, атакжеобингибировании специфического связывания меченого ли0 ганда чистой сывороткой и сывороткой с концентрацией диазепама 100 нг/мл. Из табл.5 видно, что метанол сильно ингибирует связывание 3H-Ro 15-1788 - уже при его концентрации 0,5%-ное ингибирование до5 стигает 68,5%. При концентрации метанола в инкубационной смеси 1,0; 2,0 и 3,0% ингибирование достигает 81,7; 88,5; 93,1 % соответственно. И хотя при концентрации 0,5% ингибирование чистой сывороткой специ0 фического связывания 3H-Ro 15-1788 незначительно, рабочий диапазон метода настолько сужен (счет радиоактивности при этом составляет не более 150 срт), что ошибка определения составляет более 70%.

5 В силу этих причин проводить предварительную обработку исследуемого образца метанолом не представляется возможным. В связи с тем, что зависимость величины FJ (равной SBo/BSi-1) от концентрации

0 диазепама в сыворотке линейна, в диапазоне концентраций от 10 до 1500 нг/мл мы отказались от построения калибровочной кривой для определения уровня диазепама в исследуемых образцах, а для расчета кон5 центраций использовали коэффициент пересчета К Fk/ЮО, вычисленный для контрольной сыворотки. Концентрация диазепама выбрана как вызывающая 50%-ное ингибирование специфического связыва0 ния 3H-Ro 15-1788 в данных условиях постановки эксперимента. Для более надежного определения коэффициента величины SB0, SBk определяются в 4 параллелях излучения. Распределение ошибки

5 определения при расчете концентраций бензодиазепина в исследуемых образцах с помощью коэффициента пересчета от концентрации диазепама в сыворотке показало, что ошибка определения е диапазоне юнцентраций от 100 дс 1500 нг/мл не превышает 10%, в области от 20 до 50 нг/мл она равна 20-15%, что является верхней границей допустимой ошибки для биологических методов, Учитывая то, что терапевтический диапазон концентрации диазепама в сыворотке крови составляет 50-2000 нг/мл (при различных способах введения лекарственного средства), увеличение ошибки определения при малых концентрациях не снижает достоинств предлагаемого способа. Коэффициент корреляции между добавленным в сыворотку известным количеством диазепама и определенным предлагаемым способом составил 0,97 в диапазоне концентраций от 20 до 2000 нг/мл, что говорит о высокой точности способа.

Предлагаемый способ прост в исполнении, поскольку исключает этапы центрифугирования, переноса аликвот и дополнительного разведения образца при проведении предварительной обработки. Значительно упрощен расчет концентраций бензодиазепина в исследуемых образцах сыворотки, т.е. исключается построение калибровочной кривой, что уменьшает объем работы. Кроме того, чувствительность способа в 3,2 раза выше по сравнению с прото- типом и является достаточной для определения диазепама в сыворотке крови больных, находящихся на курсовой терапии бензодиазепинами. Для определения уровня других бензодиазепинов в сыворотке крови (не диазепама) требуется в качестве контрольной сыворотки использовать сыворотку, содержащую интересующий бензо- диазепин.

Упрощение способа определения бензодиазепинов и увеличение чувствительности означает, что предлагаемый способ может быть использован для проведения широкого лекарственного мониторинга в клинической практике. Применение предлагаемого тест-набора для осуществления способа значительно упростит работу персонала биохимических лабораторий, Данный способ может быть использован в клиниках для определения целесообразности применения данного препарата у конкретного больного. Проведение клинико-фармакологических исследований с целью оптимизации психофармакотерапии, например для установления взаимосвязи фармакокинетических параметров после введения разовой тест-дозы и последующей эффективности терапии бензодиазепинами, а также предикция равновесного содержания препарата в сыворотке крови при курсовой терапии на основе тест-дозы,

установления зависимости развития побочных эффектов от концентрации препарата в сыворотке, может значительно облегчить выбор препарата для лечения больного, установление оптимальных дозировок, режимов и путей введения. Кроме того, предлагаемый способ может быть использован для исследования фармакокинетики вновь синтезируемых лекарственных соединений класса бензодиазепинов, а также для определения уровня других бензодиазепинов в сыворотке крови больных, т.к. способ является универсальным для препаратов этого класса.

Формула изобретения

1.Способ определения бензодиазепинов в сыворотке крови путем обработки сыворотки, смешивания ее с рецепторным материалом и радиоактивным лигандом, инкубации полученной смеси с последующим отделением связанного с рецептором ли- ганда методом фильтрации, подсчета величины радиоактивности и расчета процента ингибирования связывания в сравнении с контролем, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа за счет исключения стадий, а также повышения чувствительности, сыворотку обрабатывают этиловым спиртом при объемном соотношении 1 :2,25Ч в качестве радиоактивного ли- ганда используют 3H-Ro 15-1788, а в среду инкубации дополнительно добавляют

у-аминомасляную кислоту в концентрации 500 мкМ.

2.Среда инкубации для определения бензодиазепинов в сыворотке крови,содержащая рецепторный материал, радйоактивный лиганд, трис-буфер, немеченый диазепам, этиловый спирт, соляную кислоту, воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения качества за счет увеличения чувствительности определения, среда

дополнительно содержит у-аминомасляную кислоту, а в качестве лиганда 3H-Ro 15-1788 при следующем соотношении компонентов, % на 1 мл:

Рецепторный материал0,136

у-Аминомасляная кислота5,15

Этиловый спирт3,0

3H-Ro 15-17885,88-10 9-8,82.

Немеченый диазепам3,64-10 4

Трис-буфер0,605

0,04 Остальное

Соляная кислота Вода

Таблица

Изобретение относится к области биологии, в частности к биологической химии, и касается способа измерения уровня диазе- пама в биологических жидкостях. Изобретение может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга, а также скрининга новых психотропных препаратов и проведения клинико-фарма кологических исследований. Целью изобретения является упрощение и повышение чувствительности способа измерения уровня бензодиазепинов в сыворотке крови. Способ заключается в предварительной обработке сыворотки крови с помощью этилового спирта без дальнейшего отделения белкового преципитата, смешении ингредиентов инкубационной смеси (в качестве радиоактивного лиганда используется 3H-Ro 15-1788, антагонист бензодиазепиновых рецепторов, инкубационная смесь содержит500 мкМ ГАМК), инкубации, разделении свободного и связанного с рецептором меченого лиганда; просчете радиоактивности связанного меченого лиганда; расчете процента ингибирования и определении диазепара в исследуемом образце с помощью рассчитанного на основе контрольной точки коэффициента. 2 с.п ф- лы, 5 табл сл С

Таблица2

ТаблицаЗ

Т а б лица 4