Способ определения связывающей способности рецепторных белков со стероидными гормонами Советский патент 1984 года по МПК G01N33/48 

Изобретение относится к биохимик стероидных гормонов и может быть ис пользовано для количественного опре деления связывающей способности рец торов стероидных го.рмонов в разных тканях, преимущественно в тканях органов-мишеней. Способ количественного определения белка имеет важное знатение при исследовании рецепторов стероидных гормонов, так как используется для вычисления связывающей споробности этих рецепторов к стероидам в большинстве методов их определения в тканях. I, Известен способ определения свя.зьшающей способности редепторных белков.со стероидн ми згормонами. . Однако, белки - рецепторы-составляют лишь незначительную часть суммарных белков цитозольной фракции и известный способ не позволяет провести количественное определение рецепторных белков стероидных гормонов, поэтому вычисление связывающей способности с использованием суммарного белка не точно отражает связывающую способность рецепторов стероидных гормонов. Кроме того, при определении белка по известному способу невозможно учесть-вклад, . который вносят белки крови, присутствующие в тканях животных и особен но человека (эбиопсийный материал, удаление тканей при операциях) в значительных количествах. Цель изобретения - повышение точ ности способа. Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения связывающей способности рецепторных белков со стероидными гормон |ми путем добавления к биологической пробе радйоактивно.го стероидного гормона, определения радиоактивности в.пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осалсдением рецепторов стеротздных гормонов протаминсульфатом до.полнительно определяют белок к осадке после добавления протаминсульфата к биологич.еской жидкости в конечной концентрации 0,08-0,125% . а связывающую способность N (моль/мг определяют по формуле N bZ-k С -В 27 А. - радиоактивность стероидного гормона в лробе без добавления нерадиоактивных стероидных Гормонов; 2 радиоактивность стероидного гормона в пробе с добавлением нерадиоактивных стерои,цных Гормонов; С - количество белка в осадке после добавления протаминсульфата;В - удельная радиоактивность стероидного гормона. Способ осуществляют следующим образом. К части цитозольной фракции добавляют раствор протаминсульфатг в буфере, чтобы получить конечную концентрацию протаминсульфата в растворе 0,08-0,125%. Образующийся осадок центрифугируют и промывают дополнительно исходным раствором протаминсульфата, а затем растворяют в минимальном объеме ледяной уксусной кислоты.К раствору рецепторных белков в ледяной уксусной кислоте добЗйляют водный концентрированный раствор едкого натра для нейтр.ализации уксусной кислоты до рП 8,0-8,5 Объемы уксусной кислоты и кощентрацию раство.ра едкого натра выбирают с таким расчетом, чтобы конечный объем,используемьй для определения белка, соответствовал методике определения белка. Количественное определение белка предлагаемым способом проверено на цитозольных фракциях ткайей рака . молочной железы, рака и аденомы предстательной железы, матки и вентральной простаты крыс линии Вистар весом 120-130 г. Пример 1.Ткань (рак -молоч;ной железы человека) измельчали в ;ступке при охлаждении жидким азотом, рмешивали с буфером (состав буфера: 10 моль/л трис-НС ; 1,5 моль/л ЭДТА, 1 моль/л дитиотрейтола и 0,3% азида натрия, рН 7,4 при , 10 об.% глицерин в соотношении (4-10):1 (объем буфера в миллилитрах, вес ткани в граммах). Центрифугиру.ют после размораживания 10 мин при 2500-3000 g, затем надосадочную жидкость центрифугируют при 105000 g 60 мин. К 100 МП полученного цитозола добавляют равный объем 0., 16-0, 25%-ного раствора протаминсульфата в буфере.

Смесь инкубируют 10 мин, затем центрифугируют 10 мин при 250р-3000 g, при этом белки - рецепторы стероидных гормонов отделяют в виде осадка. Недостаточную жидкость .отбрасывают, а осадок промывают не менее 2-х и не более А-Х раз 1,0 мл охлажденного 0,08-1,25%-ного раствора протаминсульфата в буфере без дитиотрейтола. Промытый осадок растворяют в нормальных условиях в 40-60 мл ледяной кислоты, добавляют эквивалентное количество 40-60%-ного раствора .едкого натра и количественно опре.деляют белок по методу Лоури. Кон-г центрация белка для указанной ткани составляет 3-6%.

Величина связывающей способности белка исследуемой ткани молочной железы КО Н 5о6-дигидротестостероид равна 16 фемтомоль/мг.

П р и м е. р 2. К пробам цитозола полученного из ткани .аденомы предстательной железы человека анало-гично примеру 1, добавляли равный

объем раствора протаминсульфата с разной концентрацией, осадок в пробах обрабатывали и количественно определяли белок аналогично примеру 1. Связывающая ;способность белка к 5с -дигидротестостерону исследуемой ткани составила 12 фемтомоль/мг белка. ,

Использование предлагаемого способа определения рецепторных белков стероидньк гормонов в цитозольной фракхдш тканей животных и человека после осаждения протаминсульфатом позволяет точно количественно определять рецепторные белки стероидных гормонов цитозольной фракции тканей животных и человека в результате |исключения влияния белков и белков цитозольной фракции тканей, не осаждаемьк протаминсульфатом, на количественное определение белка, что обеспечивает более точное вычисле ше связывающей способности цитозольных рецепторов стероидных гормонов по отношению к стероидам.

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СВЯЗЫВАЮЩЕЙ СПОСОБНОСТИ РЕЦЕПТОРНЫХ БЕЛКОВ СО СТЕРОИДНЫМИ ГОРМОНАМИ путем добавления к биологической пробе радиоактивного стероидного гормона, определения радиоактивности в пробе без и с добавлением нерадиоактивного стероидного гормона с последующим осаждением редепторов стероидных гормонов протаминсульфатом, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, дополнительно определяют белок в осадке после добавления протаминсульфата к биологической жидкости в конечной концентрации 0,08-0,125%, а связующую способность N (моль/мг) определяют по формуле N Ai-A- С где А - радиоактивность стероидного гормона в пробе без добавления нерадиоактивных стероидных гормонов; А, радиоактивность стероидных i гормонов в пробе с добавлением нерадиоактивных стеро(Л идных гормонов; количество белка в осадке i С после добавления протаминсульфата; В удельная радиоактивность стероидного гормона. iNd 4 Ю 1C VI