Среда для определения галоперидола в сыворотке крови человека радиорецепторным методом Советский патент 1991 года по МПК G01N33/50 

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической фармакологии, и может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга путем определения в крови галоперидола и; ° -. других нейролептиков фенотиазинового и бутирофенонового ряда.

Цель изобретения - повышение чувствительности определения галоперидо- ла в крови.

Способ определения галоперидола с помощью среды инкубации осуществляется следующим образом,,

В пробирке смешивают сыворотку крови, содержащую галоперидол, 3Н спироперидол, рецепторный материал и Трис-солевой буфер, перемешивают и инкубируют эту смесь. После инку- .бации разделяют свободный и связанный меченый лиганд эН-спироперидол с по мощью фильтращш под вакуумом и просчитывают радиоактивность связанного меченого лиганда. Концентрация гало- перидола в сыворотке определяется по калибровочной кривой на основе рассчитанного процента ингибирования

W

10

31572234

специфического связывания сыворотками с( препаратом,

В состав среды инкубации для осуществления способа включены: 3 Н-спи- роперидол, в качестве рецепторного материала - синаптосомальная фракция из хвостатого ядра постмортального мозга человека, набор калибровочных с|ывороток, содержащих стандартные количества галоперидола, 2- мМ раст- врр (+)-бутакламола, навески для приготовления Трис-солевого буфера и буфера для промывки фильтров.

Пример 1 „ Материалы и методы, jc Рецепторный материал: хвостатое ядро постмортального материала мозга чело- , века гомогенизируют в 20 объемах 0,32 М сахарозы и центрифугируют при 1000 g 15 мин. Осадок отбрасывают, a 2Q супернатант центрифугируют при 17000 g 30 мин. Далее полученный осадок трижды промывают в 50 объемах 5,0 мМ Трис-НС1-буфера при рН 7,7 с

помощью ресуспендирования и последую-25 гцего центрифугирования при 3000о 20 мин. Конечный осадок разводят до концентрации 190-200 мг ткани/мл 50 мМ Трис-НС1 буфером, содержащим. 0,1%-ную аскорбиновую кислоту, 10 мкК ,Q паргилина, 120 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCL, 1 мМ MgCl2 (Трис-солевой буфер)„ Суспензию разливают на алик- йоты и хранят до использования при -70°С.

Стандарты: в работе используют сыворотки, содержащие стандартные количества галоперидола, с концентрациями последнего 100, 40, 20, 5, 2,

1нг/мл, которые готовят с помощью добавления к 1 мл сыворотки 50 мкл соответствующего стандартного раствора галоперидола в 50 мМ Трис-НС1 буфере при рН 7,7. Для определения неспецифического связывания готовят

2мМ раствора (+)-бутакламола0

Меченый лиганд: 3Н спироперидол: 2,0-3,0 нМ в 50 мМ трис-HCl буфере при рН 7,1 (фирма NEN) . 88 Ки/ммоль.

Процедура определения. В стеклянной пробирке объемом 10 мл смешивают 40-150 мкл сыворотки, содержащей стандартные концентрации галоперидо- ла, 100 мкл 3Н-спироперидола (конечная концентрация 0,2-0,3 нК),

35

40

45

50

гомогенизируют. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при комнатной температуре (20-2JeC) в течение 45 мин. Далее в каждую пробирку добавляют по b мл холодного Трис-HCt буфера при рН 7,7, и немедленно филь руют под вакуумом через стекловолок- нистые фильтры GF/В. Фильтры промывают еще 2 раза по 5 мл тем же буфером и помещают в сцинтилляционные флаконы с 8 мл сцинтиллятора Bray Радиоактивность проб подсчитывают через 18 ч.

Для определения неспецифического связывания в пробирку, содержащую сыворотку без галоперидола вносят 10 мкл 2 мМ раствора (+)-бутакламола Специфическое связывание вычисляют как разность между пробами, не содер жащими и содержащими (н-)-бутакламол. При обработке результатов вычисляют процент ингибированич сывороткани. содержащими стандартные количества галоперидола, специфического связывания 3Н-спироперидола в присутствии сыворотки, Не содержащей галоперидол

Пример 2о Аналогично примеру 1, но с изменением концентрации компонентов среды инкубации Результаты по определению чувствительности опре деления галоперидола приведены в таб лице.

Среда указанного состава позволяет в два раза повысить чувствительность определения галоперидота в сыворотке крови по сравнению с прото типом.

Формула изобретения

Среда для определения галоперидо™ ла в сыворотке крови человек радио- рецепторным методом, включающая Трис-буфер, сыворотку крови, рецеп- торный материал, Г3Hi спироперидол, (+)-бутакламол и аскорбиновую кислоту, воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения качества продукта за счет усиления чувствительности определения галоперидола, в качестве рецепторного материала среда содержит синаптосомальную фракцию хвостового ядра постморталь- кого мозга человека и дополнительно

250 мкл Трис-солевого буфера и 500 мкл 5 содержит паргилин и солевые добавки

мембранного материала, который передв виде NaCl, KCl, CaCl и MgCl2 при

использованием размораживают, разво-следующем соотношении компонентов,

дят в 10 раз Трпс-солевым буфером

0

c , Q

5 Q

5

0

5

0

гомогенизируют. Содержимое пробирок перемешивают и инкубируют при комнатной температуре (20-2JeC) в течение 45 мин. Далее в каждую пробирку добавляют по b мл холодного Трис-HCt буфера при рН 7,7, и немедленно фильтруют под вакуумом через стекловолок- нистые фильтры GF/В. Фильтры промывают еще 2 раза по 5 мл тем же буфером и помещают в сцинтилляционные флаконы с 8 мл сцинтиллятора Bray . Радиоактивность проб подсчитывают через 18 ч.

Для определения неспецифического связывания в пробирку, содержащую сыворотку без галоперидола вносят 10 мкл 2 мМ раствора (+)-бутакламола. Специфическое связывание вычисляют как разность между пробами, не содержащими и содержащими (н-)-бутакламол. При обработке результатов вычисляют процент ингибированич сывороткани. содержащими стандартные количества галоперидола, специфического связывания 3Н-спироперидола в присутствии сыворотки, Не содержащей галоперидол.

Пример 2о Аналогично примеру 1, но с изменением концентрации компонентов среды инкубации Результаты по определению чувствительности определения галоперидола приведены в таблице.

Среда указанного состава позволяет в два раза повысить чувствительность определения галоперидота в сыворотке крови по сравнению с прототипом.

Формула изобретения

Среда для определения галоперидо™ ла в сыворотке крови человек радио- рецепторным методом, включающая Трис-буфер, сыворотку крови, рецеп- торный материал, Г3Hi спироперидол, (+)-бутакламол и аскорбиновую кислоту, воду, отличающаяся тем, что, с целью повышения качества продукта за счет усиления чувствительности определения галоперидола, в качестве рецепторного материала среда содержит синаптосомальную фракцию хвостового ядра постморталь- кого мозга человека и дополнительно

содержит паргилин и солевые добавки

Изобретение относится к медицине, в частности к клинической фармакологии, и может быть использовано в лечебной практике для проведения лекарственного мониторинга путем определения в крови галоперидола и iдругих нейролептиков фенотиазияового и бутирофенонового ряда. Цель изобретения - повышение чуствительности определения галоперидола в крови. Сущность изобретения заключается в том, что при радиорецепторном методе определения галоперидола в качестве рецепторного материала среда содер- -жит синаптосомальную фракцию хвостатого ядра постмортального мозга человека и дополнительно содержит парги- лин и солевые добавки в виде NaCl, KCl, CaClg. и KgClz при следующем содержании компонентов, мг.%: рецеп торный материал 900-100(1, сыворотка крови 14 10Э-15- 10Э ; f3 Н спиропери- дол 7,9 ,8-10-6; ( + )-бутакла- 75,2 Ю 3; паргилин 0,05; аскорбиновая кислота 25,0; Трис 151,2; NaCl 175,5; KCl 9,31; CaCl2 2,77; MgCl2 5,07 и НС1 41,bo Указанный состав предлагаемой среды инкубации позволяет в два раза повысить чувствительность опредепения галоперидола в сыворотке крови радиорецепторным методом. 1 табл0