Способ получения гаплоидного каллуса исчезающих видов кедра Советский патент 1989 года по МПК C12N5/00 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции лесных пород для ускоренного получения константных, форм, в исследованиях по экспериментальной эмбриологии и лесной генетике.

Цель изобретения - увеличение кал- лусообразования.

Способ состоит в том, что для индукции каллуса используют аномальные пыльцевые зерна, которые содержатся н пыльце микростробилов, собранйых в .фазе начала цветения.

Способ осуществляется следующим образом.

С деревьев кедра (атласского, ливанского и гималайского) в фазу начала цветения собирают пыльцу и готовят постоянные препараты - мазки развития микрогаметофита, окрашенные

метиловым зеленьм пиронином. Препараты анализируют под микроскопом и отбирают деревья, в пыльце которых содержится 2-4% аномальных пыльцевых зерен.

Пыльцу из микростробилов собирают в фазу начала цветения, поскольку микростробилы, собранные в более ранние сроки, не раскрываются при помещении их в пробирку, а собранные позже не содержат необходимых для индукции каллуса аномальных пыльцевых зерен.

Как показал цитоэмбриологический анализ, в микростробштах кедра, используемых в предлагаемом способе, содержится следующая смесь пыльцевых зерен: 1) оптически пустые пьтьцевые зерна, 2) микроспоры, 3) фертильные пыльцевые зерна, 4) пыльцевые зерна с ускоренным развитием мужского гаметофита, 5) пыльцевые зерна с замедленым развитием мужского гаметофита, 6) жизнеспособные пыльцевые зерна негаметофитного пути развития, 7) жизнеспособные пыльцевые зерна, 8) пыльцевые зерна с тремя-четырьмя воздушными мешками и гигантские пыльцевые зерна.

В результате исследований установлено, что именно клеточные структуры 5-8, которые можно объединить под o6uuiM названием аномальные ,пыльцевые зерна, дают начало формированию гаплоидного каллуса in vitro. Максимально возможное число таких структур в пыльце кедров без дополнительной индукции составляет 4%. Если в пыльце содержится менее 2% этих клеточны структур (аномальных пыльцевых, зерен то формирование каллуса подавляется пьшьцевыми зернами, которые образуют пыльцевые трубки, формируют базально стебельковый комплекс и гаметы.

Закрытые микростробилы стерилизуют и после помещения аномальных пыльцевых зерен на питательную среду получают гаплоидный каллус.

Пример 1. Приготовление препаратов-мазков включает фиксацию и обезвоживание объекта, насьш;ение его растворителями бальзама, приклеивание белком, окрашивание и заключение в бальзам. Для фиксации используют фиксатор Карнуа, состояш 1й из 6 ч абсолютного (100%) или 96%-ного этанола, 3 ч. хлороформа и 1 ч ледяной уксусной кислоты. Затем готовят белок для наклеивания объекта. Зрелую пыльцу или содержимое пыльника фиксируют непосредственно на предметном стекле, делают мазок диаметром не более 2 см, подсушивают, промывают 70%-ньм этанолом и снова подсушивают затем приклеивают белком и окрашиваю пиронином метиловым зеленым. Время окрашивания у кедра составляет 18 ч. После окрашивания проводят дифференциацию в 96%-ном этаноле в течение 12 мин. Затем препараты обезвоживают в бутаноле первом и втором (в общей сложности 1 ч), просветляют в ксилоле первом и втором (не менее 2 ч) и заключают в бальзам.

Анализ.препаратов проводят при малом увеличении. Просмотр и излучение препаратов осуществляется по диагоналям, проведенным мысленно че5.

0

0

рез покровное стекло, не менее чем в десяти полях зрения с тем, чтобы было учтено не менее, тысячи пыльцевых зерен каждого варианта. Учитывают все типы аномального морфогенеза мужского гаметофита.

С отобранных таким образом деревьев кедра атласского, содержащих 2-4% аномальных пыльцевых зерен, собирают в фазу начала цветения цельные закрытые микростробилы, которые дезинфицируют обжиганием, оборачивают стерильной фильтровальной бумагой 5 так, чтобы микростробилы, не проваливаясь, с трудом входили в пробирку. Подготовленные таким образом микростробилы вводят в пробирки, на 1/3 : наполненные питательной средой Мура- сиге-Скуга. Пробирки закрывают стерильными ватно-марлевыми пробками.

Через 27-34 сут, в зависимости от оводненности диплоидных тканей микростробила, в каждой из пробирок формируется гаплоидный каллус, пригодный для дальнейшей работы по регенерации растений.

Пример 2. Все приемы аналогичны приемам примера 1, только исследуется кедр ливанский и используется питательная среда Нича.

0

Пример 3. Осуществляется аналогично примерам 1 и 2, только исследуется кедр гималайский и используется питательная среда Уайта.

Кроме данных примеров, аналогично аномальные пыльцевые зерна всех трех исследуемых видов кедра высаживали на все указанные вьш1е питательные среды.

Результаты опытов сведены в таблицу.

Формула изобретения

Способ получения гаплоидного кал- луса исчезающих видов кедра, включающий культивирование на искусственной питательной среде вьщеленных микроспор и микрогаметофитов, о т- личающийся тем, что, с целью увеличения каллусообразования, для индукции каллуса используют аномальные пыльцевые зерна, находящиеся в пыльце микростробилов, собранных, в фазе начали цветения, при содержании их в микростробилах 2-4%.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в селекции лесных пород для ускоренного получения константных форм, в исследованиях по экспериментальной эмбриологии и лесной генетике. Целью изобретения является увеличение каллусообразования. Способ состоит в том, что для индукции каллуса используют аномальные пыльцевые зерна, содержащиеся в пыльце микростробилов, собранных в фазе начала цветения. Получен гаплоидный каллус, пригодный для дальнейшей работы по регенерации растений, у кедра атласского, кедра ливанского, кедра гималайского на питательных средах Мурасиге-Скуга, Нича, Уайта. 1 табл.