Способ получения удвоенных гаплоидов из микроспор в культуре пыльников in vitro ячменя обыкновенного (Hordeum vulgare) Российский патент 2024 года по МПК A01H1/06 C12N15/82 

Область техники

Изобретение относится к биотехнологии растений и может быть использовано для получения андроклинных гаплоидных (моноплоидных) форм с последующим удвоением хромосом растений-регенерантов и гомозиготных (инбредных) линий в перовом поколении для увеличения темпов селекционного прогресса и выведения новых сортов ячменя обыкновенного (Hordeum vulgare) с ценными сельскохозяйственными признаками.

Уровень техники

H. vulgare по праву считается одним из самых ценных возделываемых злаков в мире, поскольку является сельскохозяйственной культурой многоцелевого использования (ячмень - важный источник продовольствия, кормов и солода). По посевным площадям ячмень уступает лишь пшенице, рису и кукурузе [Wiegmann M. et al. 2019]. Широкий ареал возделывания H. vulgare обусловлен его универсальностью (востребованностью в пищевой промышленности и кормопроизводстве), высокой адаптируемостью к контрастным условиям среды. Устойчивость к стрессу, в свою очередь, делает ячмень основным источником питания в странах с засушливым и полузасушливым климатом из-за его продуктивности и сохранения урожайности под влиянием абиотических факторов, в отличие от пшеницы и других злаковых культур. Поэтому ячмень - вторая по значимости зерновая культура в Российской Федерации в широком спектре географических и климатических зон [Баташева Б.А., Куркиев У.К., Керимов Н.С. 2014].

По данным Продовольственной и сельскохозяйственной организации Объединённых Наций (https://www.fao.org), более двух миллиардов человек на планете живет в условиях дефицита воды. И с каждым годом число людей, проживающих на засушливых территориях и страдающих из-за отсутствия осадков, продолжает расти вследствие изменения климата и расширения подверженных засухе земель. Для обеспечения продовольственной безопасности страны в постепенно меняющихся погодных условиях необходимо расширить генетическое разнообразие ячменя, что позволит относительно быстро создавать на основе выведенных гомозиготных форм с ценными комбинациями аллелей новые сорта ячменя, устойчивые к различным стрессорам. В связи с тем, что H. vulgare - диплоидное растение, ячмень является удобной моделью для гаплоидной селекции. Преимущество данной технологии заключается в том, что она позволяет получить моноплоиды с последующим удвоением хромосом и чистые гомозиготные линии за счет быстрого отбора растений с желаемыми характеристиками (комбинациями ценных признаков) в течение года, что на пять-шесть лет быстрее, чем выведение инбредных форм при помощи подходов традиционной селекции (длительного периода самоопыления) [Islam, S. M. S., & Tuteja, N. 2012].

Несмотря на достигнутые за последние десятилетия успехи в области биотехнологии растений, в частности, в получении удвоенных гаплоидов (DH, DH-линий, doubled haploid) сельскохозяйственных культур, все еще существует ряд проблем, затрудняющих выведение DH-линий, которые до сих пор не решены. Сложность использования тех или иных подходов для создания гаплоидных форм с последующим получением растений с удвоенным набором хромосом связаны с невысокой эффективностью, а именно: с низкой воспроизводимостью результатов, низкой отзывчивостью тех или иных видов эксплантатов (женских и мужских гаметофитов) в культуре in vitro, высоким процентом генерации растений-альбиносов и сильной зависимостью итогового результата от генотипической специфичности (класс, вид, сорт).

В настоящее время существует несколько способов, ведущих к получению удвоенных гаплоидов: отдаленная гибридизация (SU 1662443, CN 101142894, WO 2005084420), гиногенез (Marin-Montes I.M. et al. 2022, G. Bartoli, C. Felici and Castiglione M.R. 2012), культура микроспор (CA 2609528, RU 2557389, US 6764854, WO 2017017108) и культура пыльников in vitro (US 5770788, US 6362393, Ana María Castillo 2021, Csaba Lantos 2023, Abouzar Asadi 2021, Ludmila Ohnoutkova 2019).

Для удвоения гаплоидного набора хромосом часто используют антимитотические вещества (колхицин и др.), обычно являющиеся высокотоксичными ядами (алкалоидами).

Наиболее близким аналогом заявляемого изобретения является метод, опубликованный авторами Ludmila Ohnoutkova et al. в 2019 году [Ludmila Ohnoutkova et al. Barley Anther Culture. Methods Mol Biol. 2019: 1900: 37-52. doi: 10.1007/978-1-4939-8944-7_4]. У метода, разработанного Ludmila Ohnoutkova et al. есть ряд недостатков: использование для удвоения гаплоидного набора хромосом растений-регенерантов опасного для здоровья человека (оператора биотехнологической лаборатории) и негативно влияющего на развитие растений (образование анеуплоидов, химер и др.) высокотоксичного ингибитора митоза, колхицина; зависимость эффективности метода от генотипической специфичности растений, высокая вероятность получения растений с дефектом по содержанию в листьях хлорофилла.

Таким образом, существует необходимость совершенствования технологий, ведущих к получению удвоенных гаплоидов H. vulgare.

Раскрытие изобретения

Задача настоящего изобретения заключается в разработке способа получения удвоенных гаплоидов из микроспор в культуре пыльников in vitro ячменя обыкновенного.

Технический результат настоящего изобретения заключается в разработке способа получения удвоенных гаплоидов из микроспор в культуре пыльников in vitro H. vulgare, который характеризуется независимым от генотипа высоким уровнем каллусообразования, спонтанного удвоения гаплоидного набора хромосом в культуре пыльников in vitro, а также получением большего количества зеленых растений-регенерантов, адаптированных к условиям ex vitro. Указанный способ не включает использование для получения удвоенных гаплоидов ячменя опасных для оператора биотехнологической лаборатории и ингибирующих рост растений веществ, таких как амипрофос-метил, колхицин и его производные, оризалин и другие.

Указанный технический результат достигается посредством осуществления способа получения удвоенных гаплоидов из микроспор в культуре пыльников in vitro растений ячменя обыкновенного Hordeum vulgare включающий:

а) выращивание растений-доноров при температуре 18-20°С и влажности 55-60% при фотопериоде 14 часов день и 10 часов ночь, и соотношении минеральных элементов в почвенной смеси NH₄NO₃ - 145-155 мг/л, К₂О - 295-310 мг/л, P₂O₅ - 265-280 мг/л;

б) обработку срезанных колосьев ячменя гамма-излучением в дозе 5 Гр при мощности дозы 60 Гр/ч с последующим воздействием на колосья холодового стресса при температуре + 4°С в течение 1-4 суток;

в) выделение пальников из колосьев в стерильных условиях;

г) инкубацию пыльников на бедной агаризованной среде с высокой концентрацией маннитола 140-170 г/л и 2% агар-агар и обработку комбинацией стрессовых факторов: углеродное и азотное голодание, осмотический стресс, в течение 4-6 суток при температуре 25°С;

д) на 4-6 сутки после инкубации на стадии (г) осуществляется перенос пыльников на индукционную среду, включающую макроэлементы KNO₃ - 2900-3100 мг/л, NH₄NO₃ - 150-200 мг/л, (NH₄)₂SO₄ - 110-150 мг/л, MgSO₄⋅7H₂O - 200-300 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O - 130-170 мг/л, NaH₂PO₄⋅H₂O - 130-170 мг/л; вспомогательные вещества агар-агар - 8-12 г/л, Д-мальтозу - 90-120 г/л, тиамин хлорид - 0,25-0,35 м/л; синтетические регуляторы роста индол-3-уксусную кислоту - 5,2-6,5 мкмоль/л, 6-бензиламинопурин - 3,8-5,4 мкмоль/л; pH - 5,7-5,8, и инкубация при 25°С в течение 5-6 недель;

е) культивирование морфогенных структур, полученных на стадии (д), на регенерационной безгормональной среде в течение двух недель при температуре 25°С;

ж) выращивание растений-регенератов, полученных на стадии (е), в течение 5 суток с постепенным снижением влажности от 100% до 55-60% при фотопериоде 14 часов день и 10 часов ночь и температуре 18-20°С в грунте с соотношением минеральных элементов в почвенной смеси: NH₄NO₃ - 145-155 мг/л, К₂О - 295-310 мг/л, P₂O₅ - 265-280 мг/л.

В частных вариантах воплощения изобретения до стадии (а) семена ячменя обыкновенного стратифицируют при температуре 4°С в течение 2-3 недель.

В частных вариантах воплощения изобретения выращивание на стадии (а) осуществляют при фотосинтетической активности излучения 420-450 мкмоль/м²/с.

В частных вариантах воплощения изобретения растения-доноры на стадии (а) выращивают до стадии раннего трубкообразования с удлиняющимся влагалищем флагового листа.

В частных вариантах воплощения изобретения культивирование морфогенных структур на стадии (е) осуществляют при увеличении фотосинтетически активного излучения от 50 до 420-450 мкмоль/м²/с.

В частных вариантах воплощения изобретения индукционная среда на стадии (д) включает KNO₃ - 3000 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O - 150 мг/л, MgSO₄⋅7H₂O - 250 мг/л, NH₄NO₃ - 165 мг/л, (NH₄)₂SO₄ - 134 мг/л, NaH₂PO₄⋅H₂O - 150 мг/л, MnSO₄⋅4H₂O - 22,3 мг/л, ZnSO₄⋅7H₂O - 8,6 мг/л, H₃BO₃ - 6,2 мг/л, KI - 0,83 мг/л, Na₂Mo₄⋅2H₂O - 0,25 мг/л, CoCl₂⋅6H₂O - 0,025 мг/л, CuSO₄⋅5H₂O - 0,025 мг/л, FeNa₂EDTA - 40 мг/л, индол-3-уксусная кислота - 5,7 мкмоль/л, 6-бензиламинопурин - 4,4 мкмоль/л, глутамин - 750 мг/л, мио-инозитол - 100 мг/л, глицин - 2 мг/л, никотиновая кислота - 0,5 мг/л, пиридоксина хлорид - 0,5 мг/л, тиамина хлорид - 0,1 мг/л, Д-мальтоза - 105,2 г/л, агар-агар - 10 г/л, тиамина хлорид - 0,3 г/л.

В частных вариантах воплощения изобретения ячмень представляет собой яровой ячмень или озимый ячмень.

В частных вариантах воплощения изобретения сорт ячменя представляет собой Леон, Golden Promise, Ратник.

Предметом настоящего изобретения также является индукционная среда по изобретению.

Подробное раскрытие изобретения

Определения (термины)

Для лучшего понимания настоящего изобретения ниже приведены некоторые термины и аббревиатуры, использованные в настоящем описании изобретения. Следующие определения применяются в данном документе, если иное не указано явно.

В настоящем описании и в последующей формуле изобретения, если контекстом не предусмотрено иное, слова «иметь», «включать» и «содержать» или их вариации, например такие как «имеет», «имеющий», «включает», «включающий», «содержит» или «содержащий», следует понимать, как включение указанного целого или группы целых, но не исключение любого другого целого или группы целых. Указанные термины не предназначены для того, чтобы их истолковывали как «состоит только из».

Также здесь перечисление числовых диапазонов по конечным точкам включает все числа, входящие в этот диапазон.

МС - среда по прописи Мурасиге-Скуга (среда МС).

6-БАП - 6-бензиламинопурин.

ИУК - индол-3-уксусная кислота.

ФАР - фотосинтетически активная радиация, фотосинтетически активное излучение.

DH, DH-линий (doubled haploid) - удвоенные гаплоиды, линии удвоенных гаплоидов.

Hordeum vulgare (H. vulgare) - ячмень обыкновенный.

Осуществление изобретения

На сегодняшний день культивирование пыльников in vitro - самый многообещающий и технологичный метод получения андроклинных моноплоидных растений ячменя обыкновенного. Регенерация гаплоидов в культуре пыльников in vitro возможна благодаря тому, что мужская гамета с редуцированным набором хромосом под воздействием различных стрессовых воздействий меняет программу своего развития с гаметофитного пути на спорофитный, позволяя получить гаплоидные растения. Дальнейшая полиплоидизация, индуцируемая различными физическими или химическими факторами, или возникающая спонтанным образом, позволяет за короткий срок получить фертильные гомозиготные линии удвоенных гаплоидов со стабильным генотипом. Как правило, в результате скрещивания инбредных растений высока вероятность формирования более жизнеспособного и высокопродуктивного потомства, а не инбредной депрессии.

В данном документе предлагается технологически простой и безопасный способ получения удвоенных гаплоидов ячменя обыкновенного, который практически не зависит от генотипа, обладает высоким уровнем спонтанного удвоения гаплоидного набора хромосом у растений-регенерантов в культуре пыльников in vitro и характеризуется низким выходом растений альбиносов.

Указанные характеристики способа обеспечивается тем, что данный способ получения удвоенных гаплоидов ячменя из микроспор в культуре пыльников in vitro включает в себя:

1) Оптимальные условия выращивания растений-доноров: фотопериод - 14 часов день и 10 часов ночь (фотосинтетически активное излучение (далее - ФАР) 420-450 мкмоль/м²/с); температура 18-20°С и влажность 55-60%; соотношение минеральных элементов в почвенной смеси (NH₄NO₃ - 145-155 мг/л, К₂О - 295-310 мг/л, P₂O₅ -265-280 мг/л).

2) Обработку срезанных колосьев ячменя гамма-излучением в дозе 5 Гр при мощности дозы 60 Гр/ч с последующим воздействием холодового стресса при температуре +4°С в течение 1-4 суток.

3) Обработку комбинацией различных стрессовых факторов (углеродное и азотное голодание, осмотический стресс) пыльников: извлеченные из колосьев ячменя пыльники инкубируют в темноте, в течение 4-6 суток, при температуре 25°С на бедной агаризованной среде с высокой концентрацией маннитола (маннитол 140-170 г/л и 2% агар-агар).

4) Оптимальный состав индукционной среды, от которой зависит эффективность образования зеленых растений-регенерантов: макроэлементы: KNO₃ - 2900-3100 мг/л, NH₄NO₃ - 150-200 мг/л, (NH₄)₂SO₄ - 110-150 мг/л, MgSO₄⋅7H₂O - 200-300 мг/л, CaCl₂*2H₂O - 130-170 мг/л, NaH₂PO₄⋅H2O - 130-170 мг/л; вспомогательные вещества: агар-агар - 8-12 г/л, д-мальтоза - 90-120 г/л, тиамин-HCl - 0,25-0,35 м/л; синтетические регуляторы роста: индол-3-уксусная кислота (ИУК) - 5,2-6,5 мкмоль/л и 6-бензиламинопурин (6-БАП) - 3,8-5,4 мкмоль/л; итоговый pH - 5,7-5,8.

5) Отсутствие в протоколе для получения удвоенных гаплоидов ячменя опасных для оператора биотехнологической лаборатории и ингибирующих рост растений вещества, таких как амипрофос-метил, колхицин и его производные, оризалин и другие.

6) Оптимальные условия адаптации андроклинных микроклонов с удвоенным набором хромосом к условиям ex vitro: фотопериод 14 часов день при температуре 20°С и 10 часов ночь при температуре 18°С; постепенная адаптация к влажности от 100% до 55-60% в течение пяти суток; постепенная адаптация к интенсивности света от 50 мкмоль/м²/с до итоговой ФАР 420-450 мкмоль/м²/с в течение 14 суток, соотношение минеральных элементов в почвенной смеси: NH₄NO₃ - 145-155 мг/л, К₂О - 295-310 мг/л, P₂O₅ - 265-280 мг/л.

Пример 1

Семена ячменя обыкновенного (ярового или озимого) предварительно стратифицируют при температуре 4°С в течение 2-3 недель, стерилизуют в 75% этаноле. Семена яровых сортов ячменя проращивают в климатической камере в чашках Петри на смоченной дистиллированной водой двуслойной фильтровальной бумаге в течение 7 суток в темноте при температуре 20°С, а семена озимых сортов ячменя проращивают в климатической камере при температуре 6°С.

В отличие от сортов ярового ячменя, ювенильные растения которого без дополнительной обработки сразу пересаживают в грунт (почвенную смесь) по два растения на горшок объемом 5 л и культивируют при температуре 18-20°С, проростки озимых сортов после пересадки подвергают дополнительному воздействию низких положительных температур (6-8°С) и культивируют их таким образом на протяжении двух недель.

Растения-доноры выращивают при температурном режиме 18-20°С, уровне влажности 55-60%, около 420-450 мкмоль/м²/с ФАР и режимом освещения 14/10. Соотношение минеральных элементов в почвенной смеси: NH₄NO₃ - 145-155 мг/л, К₂О - 295-310 мг/л, P₂O₅ - 265-280 мг/л.

Ячмень выращивают до стадии раннего трубкообразования с удлиняющимся влагалищем флагового листа, что по методическому пособию «Диагностика стадий развития озимой пшеницы по шкале ВВСН» [С.Н. Кулинкович, 2014] соответствует стадии - ДК41.

С растений, достигших необходимой фазы фенологического развития (ДК41), собирают подходящие колосья, которые впоследствии подвергают гамма-облучению в дозе 5 Гр при мощности дозы 60 Гр/ч. Затем на обработанные гамма-излучением колосья оказывают воздействие холодовым стрессом в течение 1-4 суток в темноте при температуре 4°С в стакане с водой.

После воздействия стрессовых факторов колосья стерилизуют в 75% этаноле и обрабатывают партиями. Затем в стерильных условиях ламинарного бокса извлекают цветок из средней части колоса и проводят цитологический анализ изолированного пыльника для определения подходящей стадии развития микропор. Оптимальной стадией для последующей работы принято считать фазу сильновакуолизированной микроспоры. Окрашивание давленных препаратов из пыльников проводят 2% ацетокармином.

Из средней трети отобранных колосьев (содержание в пыльниках оптимальных микроспор более 50%) выделяют цветки. При извлечении пыльников из цветков удаляют верхние и нижние цветковые чешуи, завязи и рыльца. Затем пыльники пассируют на чашки Петри с бедной агаризованной средой (углеродное и азотное голодание, осмотический стресс) с высоким содержанием маннитола (маннитол - 140-170 г/л, агар-агар - 2%). Далее чашки Петри с пыльниками инкубируют в климатической камере в течение 4-6 суток в темноте при температуре 25°С.

После инкубации пыльников на бедной агаризованной среде с добавлением маннитола их переносят на индукционную среду на основе микроэлементов и витаминов среды Мурасиге-Скуга (МС) с различными концентрациями макроэлементов с добавлением синтетических регуляторов роста (5,2-6,5 мкмоль/л ИУК и 3,8-5,4 мкмоль/л 6-БАП) и вспомогательных веществ (тиамин хлорида - 0,24-0,35 мг/л, агар-агара - 8-12 мг/л и д-мальтозы - 90-120 г/л). Полный состав культуральных сред представлен в табл. 1.

Таблица 1 - Состав питательных сред для культивирования in vitro Компоненты Индукционная среда Регенерационная среда (МС) ИС-1 (среда 1, по изобретению) Среда 2 Среда 3 Макроэлементы (мг/л) KNO₃ 2900-3100 2830 1900 1900 CaCl₂⋅2H₂O 130-170 166 440 440 MgSO₄⋅7H₂O 200-300 185 370 370 NH₄NO₃ 150-200 -- 1650 1650 KH₂PO₄ -- -- 170 170 (NH₄)2SO₄ 110-150 463 -- -- NaH₂PO₄⋅H₂O 130-170 -- -- -- Микроэлементы (мг/л) MnSO₄⋅4H₂O 22,3 22,3 ZnSO₄⋅7H₂O 8,6 8,6 H₃BO₃ 6,2 6,2 KI 0,83 0,83 Na₂Mo₄⋅2H₂O 0,25 0,25 CoCl₂⋅6H₂O 0,025 0,025 CuSO₄⋅5H₂O 0,025 0,025 Источники железа (мг/л) FeNa₂EDTA 40 -- Na₂EDTA -- 37,26 FeSO₄⋅7H₂O -- 27,80 Синтетические факторы роста (мкмоль/л) ИУК 5,2-6,5 -- 6-БАП 3,8-5,4 -- Витамины и другие компоненты среды (мг/л) Глутамин 750 -- Мио-инозитол 100 100 Глицин 2 2 Никотиновая кислота 0,5 0,5 Пиридоксина хлорид 0,5 0,5 Тиамина хлорид 0,1 0,1 Дополнительные вспомогательные компоненты среды (г/л) и pH Д-мальтоза 90-120 -- Сахароза -- 20 Агар-агар 8-12 5 Тиамина хлорид 0,25-0,35 мг/л -- pH 5,7-5,8 5,7-5,8

При использовании индукционной среды с составом согласно изобретению (ИС-1) выявлен высокий процент образования каллуса в культуре пыльников ячменя обыкновенного вне зависимости от времени воздействия низкими положительными температурами в комбинации с гамма-излучением (см. табл. 2). При этом проведены сравнительные исследования с другими по составу индукционными средами, результаты которых показали, что % каллусообразования значительно выше при использовании индукционной среды по изобретению (ИС-1) по сравнению с другими питательными средами (см. табл. 2).

Таблица 2 - Влияние комбинированного воздействия стрессовых факторов на эффективность каллусообразования ячменя в индукционных средах с различными концентрациями макроэлементов Гамма-излучение, Гр Продолжительность холодового стресса, сутки Каллусообразование, % * ИС-1 (среда 1,
по изобретению) Среда 2 Среда 3 5 0 20,8 17,2 46,7 1 27,0 28,5 26,7 2 41,9 0,0 49,0 3 12,7 0,0 0,0 4 12,6 3,3 0,0 * Процент рассчитывался как: (пыльники с каллусом⋅100%) / все пыльники для каждого колоса

Также выявлено, что из морфогенного каллуса, индуцированного на среде ИС-1 (среда 1 по изобретению), получается самый высокий процент регенерации зеленых (хлорофиллсодержащих) растений на один колос как после предварительного воздействия на колосья гамма-излучением в комбинации с различной длительностью холодового стресса, так и при отсутствии обработки холодом (см. табл. 3).

Таблица 3 - Средний процент выхода зеленых растений на один колос относительно растений-альбиносов (100% = зеленые + альбиносы) Гамма-излучение, Гр Продолжительность холодового стресса,
сутки Выход зеленых регенерантов на один колос, % ИС-1 (среда 1,
по изобретению) Среда 2 Среда 3 5 0 57,1 0,0 23,4 1 51,5 50,9 27,2 2 38,6 0,0 54,3 3 82,6 0,0 0,0 4 83,3 0,0 0,0

Несмотря на формирование каллусной массы на индукционной среде 2, выход зеленых растений наблюдали только после обработки холодом в течение суток. Что касается среды 3, то холодовая обработка в течение 3 или 4 суток негативно сказалась на способности пыльников образовывать как каллус, так и зеленых регенерантов (см. табл. 3).

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что индукционная среда по изобретению ИС-1 (среда 1) обладает высокой способностью индуцировать как формирование морфогенного каллуса независимо от длительности холодового стресса, так и регенерацию зеленых растений-регенерантов с выходом удвоенных гаплоидов среди растений-регенерантов от 70% до 80,9% в зависимости от сорта (см. табл. 4).

Таблица 4 - Эффективность выхода гомозиготных растений-регенерантов с удвоенным набором хромосом ячменя в культуре пыльников in vitro по изобретению Сорт ячменя Гамма-излучение, Гр Продолжительность холодового стресса, сутки Выход зеленых регенерантов на один колос, шт Выход удвоенных гаплоидов на один колос, шт Количество гомозиготных растений, шт Леон 5 4 21 17 (80,9%) 17 Golden Promise 17 12 (70,6%) 10 Ратник 19 14 (73,7%) 14

Пыльники в чашке Петри на индукционной среде ИС-1 (Среда 1) инкубируют в темноте при 25°C в течение 5-6 недель. Морфогенные структуры (каллус и эмбриоиды), полученные из пыльников, пассируют на регенерационную безгормональную среду по прописи Мурасиге-Скуга (МС, табл. 1) и культивируют их в течение двух недель при температуре 25°С с постепенным увеличением ФАР от 50 до 420-450 мкмоль/м²/с для адаптации растений-регенерантов к высокой интенсивности света ex vitro. Далее растения-регенераты андроклинного происхождения адаптируют к условиям ex vitro:

1) для предотвращения загнивания корней с них удаляют остатки питательной среды МС, которые могут служить источником питания патогенных микроорганизмов;

2) грунт перед пересадкой обрабатывают раствором на основе биопрепарата «Триходерма Вериде 471» (ООО «Ваше хозяйство», Россия (3 г/л)) или другим биологическим пестицидом, обладающим ярко выраженным фунгицидным и бактерицидным действием;

3) растения-регенераты пересаживают в обработанный грунт с соотношением минеральных элементов в почвенной смеси: NH₄NO₃ - 145-155 мг/л, К₂О - 295-310 мг/л, P₂O₅ - 265-280 мг/л, по одному растению на горшок объемом 200-250 мл;

4) после пересадки регенеранты обрабатываются раствором удобрений для злаковых культур;

5) в течение 5 суток постепенно снижают влажность от 100% до 55-60% при фотопериоде - 14 часов день и 10 часов ночь и температуре 18-20°С.

Несмотря на то, что изобретение описано со ссылкой на раскрываемые варианты воплощения, для специалистов в данной области должно быть очевидно, что конкретные подробно описанные эксперименты приведены лишь в целях иллюстрирования настоящего изобретения, и их не следует рассматривать как каким-либо образом ограничивающие объем изобретения. Должно быть понятно, что возможно осуществление различных модификаций без отступления от сути настоящего изобретения.

Изобретение относится к области биохимии, в частности к способу получения удвоенных гаплоидов из микроспор в культуре пыльников in vitro растений ячменя обыкновенного Hordeum vulgare. Изобретение позволяет эффективно получать удвоенные гаплоиды из микроспор в культуре пыльников in vitro растений ячменя обыкновенного Hordeum vulgare. 7 з.п. ф-лы, 4 табл., 1 пр.

1. Способ получения удвоенных гаплоидов из микроспор в культуре пыльников in vitro растений ячменя обыкновенного Hordeum vulgare с выходом от 70,6% до 80,9%, включающий:

а) выращивание растений-доноров при температуре 18-20°С и влажности 55-60% при фотопериоде 14 часов день и 10 часов ночь, в почвенной смеси, включающей минеральные элементы NH₄NO₃ – 145-155 мг/л, К₂О – 295-310 мг/л, P₂O₅ – 265-280 мг/л;

б) обработку срезанных колосьев ячменя гамма-излучением в дозе 5 Гр при мощности дозы 60 Гр/ч с последующим воздействием на колосья холодового стресса при температуре +4°С в течение 1-4 суток;

в) выделение пыльников из колосьев в стерильных условиях;

г) инкубацию пыльников на бедной агаризованной среде с высокой концентрацией маннитола 140-170 г/л и 2% агар-агар и обработку комбинацией стрессовых факторов: углеродное и азотное голодание, осмотический стресс в течение 4-6 суток при температуре 25°С;

д) на 4-6 сутки после инкубации на стадии (г) осуществляется перенос пыльников на индукционную среду, включающую макроэлементы KNO₃ – 2900-3100 мг/л, NH₄NO₃ – 150-200 мг/л, (NH₄)₂SO₄ – 110-150 мг/л, MgSO₄⋅7H₂O – 200-300 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O – 130-170 мг/л, NaH₂PO₄⋅H₂O – 130-170 мг/л; вспомогательные вещества агар-агар – 8-12 г/л, Д-мальтозу – 90-120 г/л, тиамин хлорид – 0,25-0,35 м/л; синтетические регуляторы роста индол-3-уксусную кислоту – 5,2-6,5 мкмоль/л, 6-бензиламинопурин – 3,8-5,4 мкмоль/л; pH – 5,7-5,8, и инкубация при 25°С в течение 5-6 недель;

е) культивирование морфогенных структур, полученных на стадии (д), на регенерационной безгормональной среде в течение двух недель при температуре 25°С;

ж) выращивание растений-регенератов, полученных на стадии (е), в течение 5 суток с постепенным снижением влажности от 100% до 55-60% при фотопериоде 14 часов день и 10 часов ночь и температуре 18-20°С в грунте в почвенной смеси, включающей минеральные элементы NH₄NO₃ – 145-155 мг/л, К₂О – 295-310 мг/л, P₂O₅ – 265-280 мг/л.

2. Способ по п.1, в котором до стадии (а) семена ячменя обыкновенного стратифицируют при температуре 4°С в течение 2-3 недель.

3. Способ по п.1, в котором выращивание на стадии (а) осуществляют при фотосинтетической активности излучения 420-450 мкмоль/м²/с.

4. Способ по п.1, в котором растения-доноры на стадии (а) выращивают до стадии раннего трубкообразования с удлиняющимся влагалищем флагового листа.

5. Способ по п.1, в котором культивирование морфогенных структур на стадии (е) осуществляют при увеличении фотосинтетически активного излучения от 50 до 420-450 мкмоль/м²/с.

6. Способ по п.1, в котором индукционная среда на стадии (д) включает KNO₃ – 3000 мг/л, CaCl₂⋅2H₂O – 150 мг/л, MgSO₄⋅7H₂O – 250 мг/л, NH₄NO₃ – 165 мг/л, (NH₄)₂SO₄ – 134 мг/л, NaH₂PO₄⋅H₂O – 150 мг/л, MnSO₄⋅4H₂O – 22,3 мг/л, ZnSO₄⋅7H₂O – 8,6 мг/л, H₃BO₃ – 6,2 мг/л, KI – 0,83 мг/л, Na₂Mo₄⋅2H₂O – 0,25 мг/л, CoCl₂⋅6H₂O – 0,025 мг/л, CuSO₄⋅5H₂O – 0,025 мг/л, FeNa₂EDTA – 40 мг/л, индол-3-уксусная кислота – 5,7 мкмоль/л, 6-бензиламинопурин – 4,4 мкмоль/л, глутамин – 750 мг/л, мио-инозитол – 100 мг/л, глицин – 2 мг/л, никотиновая кислота – 0,5 мг/л, пиридоксина хлорид – 0,5 мг/л, тиамина хлорид – 0,1 мг/л, Д-мальтоза – 105,2 г/л, агар-агар – 10 г/л, тиамина хлорид – 0,3 г/л.

7. Способ по п.1, в котором ячмень представляет собой яровой ячмень или озимый ячмень.

8. Способ по п.1, в котором ячмень сорта Леон, Golden Promise, Ратник.