СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ТРАНСГЕННЫХ РАСТЕНИЙ КУКУРУЗЫ Российский патент 2009 года по МПК A01H1/00 A01H4/00 C12N15/82 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и биотехнологии и может быть использовано в селекции кукурузы при создании новых сортов и гибридов с помощью генной инженерии, в работах по инсерционному мутагенезу, выделению и клонированию генов кукурузы.

Известен способ получения трансгенных растений кукурузы с использованием генетических маркеров, применяемый в генетической инженерии у высших растений для отбора трансгенных растений, при котором ген nptII, который кодирует фермент неомицин-фосфотрансферазу, обусловливающую устойчивость к канамицину. Для отбора трансгенных растений, несущих ген nptII, из семян, собранных с растений-трансформантов, извлекают зародыши и выращивают их на питательной среде с канамицином (Данилова С.А. Оптимизация агробактериального метода трансформации кукурузы. Автореф. Дисс. Канд. биол. наук. М., 2001). При этом проростки, несущие и экспрессирующие ген nptII, имеют зеленый фенотип, тогда как проростки, не несущие данный ген, становятся альбиносными и погибают.

Данный способ, позволяющий отбирать у некоторых видов двудольных и однодольных растений канамицин-устойчивые трансформанты с геном nptII, имеет, однако, два существенных недостатка: высокую трудоемкость, ограничивающую объем анализируемого материала, длительность контакта зародышей с канамицином в процессе их культивирования на канамицин-содержащей среде, в результате чего нарушается развитие даже канамицин-устойчивых трансформантов.

Наиболее близким к заявляемому является способ получения трансгенных растений кукурузы на основе агробактериальной трансформации незрелых зародышей кукурузы в культуре in vitro (Zhao Z.-Y., Cai Т., Tagliani L. et al. Agrobacterium-mediated sorghum transformation // Plant Mol. Biol., 2000, v.44, pp.789-798), в соответствии с которым незрелые зародыши кукурузы помещают на 5 мин в суспензию агробактериальных клеток (плотность 0.5-1.0×10⁹ кл/мл) в среде для инокуляции, содержащей минеральные соли и витамины по MS, гидролизат казеина (1.0 г/л), 2,4-D (1.5 мг/л), глюкозу (36 г/л), сахарозу (68.5 г/л), ацетосирингон (100 µM), после чего их переносят на 3 дня на среду для сокультивирования, отличающуюся от исходной увеличенной до 2.0 мг/л концентрацией 2,4-D, сниженными до 20 и 10 г/л соответственно концентрациями сахарозы и глюкозы, добавкой L-пролина (0.7 г/л), аскорбиновой кислоты (10 мг/л), MES (0.5 г/л) и агара (8 г/л). Затем зародыши переносят на 4 дня на среду без ацетосирингона, но с добавкой антибиотика карбенициллина (100 мг/л) для подавления роста агробактерий. Затем для индукции эмбриогенного каллуса зародыши переносят на среду, отличающуюся от предыдущей отсутствием глюкозы и сниженной концентрацией 2,4-D (до 1.5 мг/л) и добавкой селективного агента фосфинотрицина (5 мг/л), ген устойчивости к которому (bar) присутствовал в Т-ДНК использованного агробактериального штамма, и культивируют в течение 2 недель. Переносят выживший (устойчивый) каллус на среду того же состава с повышенным уровнем фосфинотрицина (10 мг/л) и пересаживают каждые 2 недели. Для развития эмбриоидов каллус пересаживают на среду, отличающуюся от предыдущей добавкой кинетина (0.5 мг/л) и затем - на среду для побегообразования, отличающуюся от предыдущей отсутствием 2,4-D, увеличенной до 60 г/л концентрацией сахарозы, заменой кинетина на зеатин (0.5 мг/л), добавкой индолил, 3 уксусной кислоты (ИУК) (1 мг/л), абсцизовой кислоты (АБК) (0.1 µМ) и тидиазурона (0,1 мг/л). Побеги переносят на среду для укоренения - 1/2 Мурасиге-Скуга (MS), (нитрил, 3 уксусной кислоты (НУ К) (0.5 мг/л), индол 3 бензольная кислота (ИБК) (0.5 мг/л), сахароза (20 г/л), агар (7 г/л), а затем - на среду того же состава, но без НУК и ИБК. У полученных растений с помощью методов молекулярной генетики анализируют наличие в их геноме встройки фрагмента чужеродной ДНК (Т-ДНК агробактерий). Данный способ позволяет достигать частоты стабильной трансформации до 10.1% в расчете на количество инокулированных зародышей.

Недостатками данного способа являются высокая трудоемкость и длительность процесса получения трансгенных растений. Кроме того, использование системы культуры in vitro, во-первых, может привести к получению сомаклональных вариантов среди растений-трансформантов, во-вторых, ограничивает применение данного метода, поскольку не все образцы кукурузы (селекционно-ценные линии и гибриды) дают хорошо растущий эмбриогенный каллус с высокой регенерационной способностью, либо же их экспланты, продуцирующие эмбриогенный каллус, некротизируют в результате сокультивирования с агробактериальными клетками.

Задачей изобретения является создание более быстрого и эффективного способа получения трансгенных растений кукурузы с высоким выходом конечного продукта при сохранении высокой частоты их получения.

Техническим результатом является сокращение срока получения трансгенного растения кукурузы, снижение частоты возникновении химерных растений, расширение круга сортов, линий кукурузы, которые на практике могут быть трансформируемы.

Поставленная задача достигается тем, что в способе получения трансгенных растений кукурузы, включающем обработку генеративных органов кукурузы с помощью суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens с активированными vir-генами, согласно изобретению генеративные органы кукурузы после обработки суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens опыляют пыльцой фертильных растений, при этом в качестве генеративных органов кукурузы используют цветущий женский гаметофит кукурузы, а перед обработкой суспензию клеток штамма Agrobacterium tumefaciens с активированными vir-генами смешивают с веществами, являющимися инертными по отношению к клеткам штамма и характеризующимися осмотическим потенциалом, превышающим осмотический потенциал суспензии для получения изотонического раствора.

В качестве веществ, являющихся инертными по отношению к клеткам штамма и характеризующихся осмотическим потенциалом, превышающим осмотический потенциал суспензии, используют сахарозу и/или глицерин. При этом для получения изотонического раствора на суспензию клеток с концентрацией 1×10⁶-1×10⁸ кл/мл добавляют сахарозу или глицерин до конечной концентрации 0,5-1 М.

Кроме того, у цветущего женского гаметофита кукурузы используют пестичные нити цветущего женского гаметофита, которые перед обработкой суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens срезают на высоте 1-2 см от початка, и обработку осуществляют с помощью пипетки в глубину срезанной части пестичных нитей на выходе из початка. Опыление производят пыльцой, предварительно собранной в пакет путем ее нанесения на срез пестичных нитей пальцами или путем натряхивания.

Изобретение поясняется чертежом, где на фотографии представлен ПЦР-анализ ДНК из проростков кукурузы, трансформированной in planta, где цифрами 1-8 обозначены дорожки: 1 - ДНК из нетрансформированного растения (отрицательный контроль); 2 - маркер молекулярного веса (Fermentas, Латвия), размер фрагментов, начиная сверху: 3000, 2000, 1500, 1200, 1031, 900, 800, 700, 600, 500 п.н.; 3-8 тестируемые проростки, зерна которых прорастали без задержки на канамицине.

Технических решений с выявленной совокупностью признаков не обнаружено из уровня техники. В частности, не известно решений, касающихся способов получения трансгенных растений кукурузы, в которых в качестве объекта генетической трансформации используют цветущий женский гаметофит однодольного растения, который сначала обрабатывают суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens с активированными vir-генами, а затем опыляют пыльцой фертильных растений. Также неизвестно применение опыления цветущего женского гаметофита пыльцой фертильных растений, которое осуществляют сразу после их обработки суспензией клеток Agrobacterium tumefaciens, находящихся в специальном растворе, обработку суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens осуществляют непосредственно пестичных нитей цветущего женского гаметофита путем нанесения пипеткой внутрь срезанных на 1-2 см от початка пестичных нитей.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом: с помощью пергаментного пакета изолируют цветущий женский гаметофит у кукурузы и пестичные нити цветущего женского гаметофита перед обработкой суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens срезают на высоте 1-2 см от початка, а обработку суспензией клеток Agrobacterium tumefaciens осуществляют с помощью пипетки в глубину срезанной части пестичных нитей. Опыление производят пыльцой, предварительно собранной в пакет, путем ее нанесения на срез пестичных нитей пальцами или путем натряхивания.

Для выявления трансгенных растений семена, собранные с початков, обработанных агробактериальной суспензией, и необработанных (контрольных) початков растений исходной линии, стерилизовали 5%-ным раствором хлорамина (15 мин), интенсивно промывали в проточной воде, замачивали в дистиллированной воде (24 час), повторно стерилизовали в ламинар-боксе 5%-ным раствором хлорамина и без промывки раскладывали на агаризованную среду, содержащую канамицин (200 мг/л), и после появления корней через 2-5 дней переносили в почву в сосуды, где проращивали в течение 2-3 недель.

Женские цветки (в составе одно- или двудомных, раздельнополых) растений изолируют пергаментными изоляторами до начала цветения. Для обработки цветков используют суспензию клеток Agrobacterium tumefaciens с плотностью клеток 1×10⁷ кл/мл, в которую добавляют ацетосирингон. Женские цветки растения после обработки агробактериальной суспензией путем распыления из пульверизатора опыляют пыльцой кукурузы путем натряхивания из природных пыльников и снова изолируют или оставляют открытыми до созревания, если нет требования по устранению перекрестного опыления. С обработанных растений собирают семена, проращивают их и отбирают на среде с канамицином проростки, несущие маркерный ген. С этой целью семена стерилизовали 5%-ным раствором хлорамина (15 мин), интенсивно промывали в проточной воде, замачивали в дистиллированной воде (24 час), повторно стерилизовали в ламинар-боксе 5%-ным раствором хлорамина и без промывки раскладывали на агаризованную среду, содержащую нистатин, и после набухания и проклевывания зародыша и появления корней переносили в высокие стеклянные сосуды с агаризованной (0,4% агара) средой, содержащей канамицин 200 мкг/мл, где проращивали под ватными пробками в течение 2-3 недель, затем проростки брали на анализ на наличие встройки Т-ДНК.

У проростков, устойчивых к канамицину (зеленые проростки) брали фрагмент (1-2 см, 100 мг) ткани верхней части листа и с помощью метода ПЦР (полимеразной цепной реакции) проверяют наличие последовательности ДНК переносимого гена, используя необработанные и поверхностно-стерилизованные растения. Отбирают проростки, несущие фрагмент ДНК маркерного гена («ПЦР+» проростки), которые являются трансгенными растениями.

Заявляемый способ был реализован на растениях линии кукурузы АТ-3. В качестве доноров пыльцы служили растения этой же линии. Трансгеноз осуществляли с помощью Agrobacterium tumefaciens, при этом использовали штамм GV3101, с плазмидой pTd33, в которой присутствовал селективный маркерный ген nptII, обусловливавший устойчивость к канамицину. Суспензию клеток данных агробактериальных штаммов выращивали на качалке на питательной среде CIB (Fullner K.J., Stephenens K.M., Nester E.W. An essential virulence protein of Agrobacterium tumefaciens, VirB4, requires an intact mononucleotide binding domain to function in transfer of T-DNA. // Mol.Gen.Genet. 1994. V. 245. P. 704-715) до плотности 1×10⁷ кл/мл при комнатной температуре. По достижении необходимой плотности в суспензию добавляли ацетосирингон (200 аМ), и либо непосредственно использовали в опыте по трансгенозу, либо помещали в холодильник (t°=4-7°C) для использования в течение последующих 2-3 суток.

До начала цветения початки изолировали пергаментными изоляторами. В качестве объекта генетической трансформации использовали цветущий женский гаметофит однодольного растения, пестичные нити которого, расположенные на выходе нитей из початка, отрезали на высоту 1-2 см от початка и обрабатывали суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens с активированными vir-генами в растворе сахарозы или глицерина путем внесения 0,1-1, 0 мл суспензии с помощью пипетки или шприца в глубину срезанной части пестичных нитей, а затем в течение часа опыляли предварительно собранной в пакет пыльцой фертильных растений путем натряхивания из пакета или пальцем на срез пыльцевых трубок. Для выявления трансгенных растений семена, собранные с початков, обработанных агробактериальной суспензией, и необработанных (контрольных) початков растений исходной линии, стерилизовали 5%-ным раствором хлорамина (15 мин), интенсивно промывали в проточной воде, замачивали в дистиллированной воде (24 час), повторно стерилизовали в ламинар-боксе 5%-ным раствором хлорамина и без промывки сажали на агаровую среду (1/2 MS), содержащую канамицин (200 мг/л), и выращивали в течение 2-3 недель.

Подтверждение трансгенной природы полученных зеленых растений проводили с помощью метода ПЦР (см. чертеж). Из фрагментов листьев отобранных растений выделяли ДНК согласно общепринятым методам (Маниатис Т., Фриш., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. Лабораторное руководство. М.: Мир, 1984). Реакцию проводили с олигонуклеотидными праймерами, специфичными к фрагменту гена nptII размером 250 п.н.: ACAGACAATCGGCTGCTCTGATG и GGCAGGAGCAAGGTGAGATGACA. Продукты реакции разделяли электрофорезом в агарозном геле, в качестве маркера молекулярной массы использовали ДНК фага λ. В качестве положительного контроля использовали плазмиду pTd33.

При этом, чтобы избежать контаминации (загрязнения) растительных образцов от агробактерий фрагменты листьев раскладывали на поверхность агаризованной среды для агробактерий с канамицином 200 мкг/мл и инкубировали в термостате при 28°С 3-5 дней.

Результат анализа ДНК показал, что в ряде исследованных образцов тотально ДНК растения присутствует последовательность размером около 500 п.н., свойственная гену nptII. В расчете на число проросших зерновок частота полученных из них взрослых трансформированных растений составила более 40%.

Таким образом, приведенные данные показывают, что заявляемый способ позволяет с высокой частотой получать трансгенные растения со значительным уменьшением трудоемкости и с упрощением технологии получения трансгенных растений (процедур обработки, инкубирования, созревания, проверки на вставку Т-ДНК).

Предлагаемый способ позволяет: 1) получать трансгенные растения, минуя систему культуры in vitro, что ускоряет и упрощает процедуру получения трансгенных растений кукурузы, 2) избежать возникновения сомаклональной изменчивости; 3) избежать химерности трансформантов, проистекающей из-за развития их из многоклеточных меристем, содержащих как трансформированные, так и нетрансформированные клетки; 3) использовать для трансформации практически все известные сорта и линии кукурузы, т.к. отсутствуют ограничения по генотипам, способным к образованию хорошо растущего эмбриогенного каллуса.

Изобретение может быть использовано в селекции кукурузы при создании новых сортов и гибридов с помощью генной инженерии, в работах по инсерционному мутагенезу, выделению и клонированию генов кукурузы. Генеративные органы кукурузы обрабатывают суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens с активированными vir-генами. В качестве генеративных органов используют цветущий женский гаметофит. Перед обработкой упомянутую суспензию смешивают с веществами, инертными по отношению к клеткам штамма и характеризующимися осмотическим потенциалом, превышающим осмотический потенциал суспензии для получения изотонического раствора. В качестве таких веществ используют сахарозу и/или глицерин. После обработки суспензией генеративные органы опыляют пыльцой фертильных растений. У гаметофита используют пестичные нити, которые перед обработкой суспензией срезают на высоте 1-2 см от початка. Обработку осуществляют с помощью пипетки в глубину срезанной части пестичных нитей. Опыление производят пыльцой, предварительно собранной в пакет, путем ее нанесения на срез пестичных нитей пальцами или путем натряхивания. Способ позволяет сократить срок получения трансгенного растения кукурузы и увеличить выход конечного продукта при сохранении высокой частоты получения. 4 з.п. ф-лы, 1 ил.

1. Способ получения трансгенных растений кукурузы, включающий обработку генеративных органов кукурузы с помощью суспензии клеток штамма Agrobacterium tumefaciens с активированными vir-генами, отличающийся тем, что генеративные органы кукурузы после обработки суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens опыляют пыльцой фертильных растений, при этом в качестве генеративных органов кукурузы используют цветущий женский гаметофит кукурузы, а перед обработкой суспензию клеток штамма Agrobacterium tumefaciens с активированными vir-генами смешивают с веществами, являющимися инертными по отношению к клеткам штамма и характеризующимися осмотическим потенциалом, превышающим осмотический потенциал суспензии для получения изотонического раствора.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве веществ, являющихся инертными по отношению к клеткам штамма и характеризующихся осмотическим потенциалом, превышающим осмотический потенциал суспензии, используют сахарозу и/или глицерин.

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что для получения изотонического раствора к суспензии клеток с концентрацией 10×10⁶-10×10⁸ кл/мл добавляют сахарозу или глицерин до конечной концентрации 0,5-1 М.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что у цветущего женского гаметофита кукурузы используют пестичные нити цветущего женского гаметофита, которые перед обработкой суспензией клеток штамма Agrobacterium tumefaciens срезают на высоте 1-2 см от початка, и обработку осуществляют с помощью пипетки в глубину срезанной части пестичных нитей.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что опыление производят пыльцой, предварительно собранной в пакет, путем ее нанесения на срез пестичных нитей пальцами или путем натряхивания.