Способ определения тестостерона в биологической жидкости Советский патент 1989 года по МПК G01N33/74 

Изобретение относится к иммунохимии и иммунологическому анализу и к им- мунохимическому анализу гормонов

Цель изобретения - увеличение чувствительности, ускорение и упрощение способа

Способ определения тестостерона (тс) осуществляется следующим образом

В лунках планщетов из полистирола сорбируют белок А из раствора,содержащего 5-15 мкг/мл этого белка, в течение 16-20 ч при 4°С или не менее 2 ч при 37°С, после этого инкубируют в лунках сыворотку к ТС. После удаления избытка антител вносят смесь исследуемой пробы с конъюгатом ТС и фермента пероксидазы (ПХ)о Далее вносят хромогенный субстрат для ПХ и измеряют оптическую платность продукта пероксидазной реакции, величина которой пропорциональна концентрации ТС,

Пример 1 о Получение конъюга- тов ТС с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и с ПХ.

Предварительно готовят ТС-3-(о- карбоксиметилоксим) (ТС-ЗСМО) следующим образом, К 250 мл ТС и 230 мг аминоуксусной кислоты добавляют 30 мл 20% (об/об) водного раствора метанола и 20 мл 0,1М водного раствора ацетата натрияо Суспензию размешивают при комнатной температуре в течение 1 ч. Затем добавляют еще 2,4 г- ацетата натрия до концентрации 1М и перемешивают суспензию при нагревании до 1 ч о Добавляют дважды по 5 мл метанола при 60 С до получения прозрачного раствора и перемешивают 30 мин о Смесь оставляют при комнатной температуре на ночь, затем упаривают под вакуумом вдвое. Образовавшуюся суспензию разбавляют во- дои до 100 мл, подщелачивают до рН 8-9 0,1н. гидроксидом калия до растворения осадка. Трижды экстрагируют

(Л

и со

СП VI vj

314

30 мл этилацетатас, Экстракт упариваЙт досуха.

Конъюгат ТС-ЗСМО-БСА получают ме- смешения ангидридов „ 19 мг Т1С-ЗСМО растворяют в 2 мл диоксана. Добавляют 20 мкл трет-бутнламина и 10 мкл изо-бутилхлоркарбоната и перевешивают в течение 1 ч при 12-15 °С, При помешивании добавляют к этому pjacTBOpy раствор, содержащий 29 мг БСА, 3 мл дистиллированной воды, 2Э мкл 1н. гидроксида калия по каплям в течение 2.0 мин, перемешивают 3 ч при 0-4 с и диализируют против дистиллированной воды в течение ночи при 12-15 Со Образовавшуюся смесь п|одщелачивают бикарбонатом натрия д|о рН 8-9, осадок отфильтровывают, д|оводят рН фильтрата до 3 концентри- рЬванной соляной кислотой, образовав шЦйся осадок отбрасывают, использу- ю|г надосадочную жидкость „ Молярное соотношение ТС - БСА в конъюгате составляет

Для получения конъюгата ТС-ПХ ис- пЬлъзуют метод смешения ангидридов 2 мг ТС-ЗСМО растворяют в 1 мл без- вЬдного диоксана, содержащего 2 мкл 3-1-н-бутиламинао При охлаждении до прибавляют 0,5 мл диоксана,. сЬдержащего 1 мкл изобутилхлоркарбон та, и перемешивают при температу- р замерзания диоксана 1 ч 15 мин. раствор медленно добавляют пор- по 50 мкл к охлажденному до 4 С раствору 10 мг ПХ в. 3 мл 0,5%-но раствора бикарбонату натрия „Пос- л перемешивания 2,5 ч при 4 С про- вддят дважды диализ против 1л OjOlHo калий фосфатного буфера,содер 0,1 Не хлорид натрия, рН 7,2 () в течение 2 ч и ночи при 4 - 1,И С„Молярное соотношение ТС-ПХ в кфнъюгате составляет 6;I,

Получение гетероиммунной анти- Тф-сыворотки,

Крольчих иммунизируют конъюгатом ТФ-ЗСМО - БСА трижды (раз в 2 неде- Л1(г) внутримышечно по 1 мг (в смеси с полным адъювантом Фрейнда (1:1)) и трижды (раз в 6 недель) внутри- по 0,8 мг на кролика (вес кроликов 2,5-3 кг), Реиммунизацию про- В0ДЯТ через 9 месяцев путем двукрат- ного внутривенного введения 0,8 мг тфго же конъюгата. Кровь для получения сыворотки берут через 7-10 дней пдсле последней иммунизации.

л 5 0 5

0 с 0

5

0

Получение иммуносорбента Иммуносорбентом служит гаммагло- булиновая фракция кроличьей гетероиммунной сыворотки к ТС, связанная с белком А, адсорбированным на план- шетео

Иммуносорбент готовят сорбцией белка А стафилококка (5 мкг/мл белка А в ФБ) в лунках 96-луночных планшетов по 100 мкл на лунку в течение 18 ч при 4 Со Эта и все последующие операции ИФА сопровождаются про- мьщкой планшетов дважды водопроводной водой И дважды ФБ, содержащим 0,05% детергента тритон Х-100 или

твин-20 (ТФБ)О

Затем в лунки планшетов добавляют по 100 мкл анти-ТС-сыворотки в разведении 1:1000 в ТФБ, инкубируют в течение 2 ч при З7 с и отмьгаают ТФБ.

Полученный Иммуносорбент может храниться до использования при 4°С в течение как минимум 4 мес (срок наблюдения), поэтому время его приготовления не лимитирует время анализа ТС „

Проведение ИФА,

Аликвоты плазмы человека,(О,1 мл) экстрагируют встряхиванием с 1 мл диэтилового эфира 10-15 мин, замораживают при (-10) - () С, эфирную фракцию сливают и упаривают досуха нагреванием в водяной бане до 38-42 с« Сухой остаток растворяют в 0,1 мл ТФБо

В каждую лунку планшета с иммуно- сорбентом вносят 100 мкл образца (экстракта плазмы крови) или стандарта (разведения ТС в ТФБ с концентрацией от 50 нг/мл до 4 пг/мл) для построения калибровочной кривой и 100 мкл раствора конъюгата ТС-ПХ в ТФБ (концентрация 10 нг/мл по ПХ) и инкубируют 2 ч при 37°С,

По окончании инкубации добавляют субстратную смесь (0,04%-ный раствор о-фенилендиамина в.бидистиллированной воде, содержащей 0,008% перекиси водорода) по 100 мкл на лункуо Через 30 мин (температура комнатная) останавливают реакцию добавлением 100 мкл 2М серной кислоты и регистрируют оптическую плотность продукта фермен- . тативной реакции при 490 нм,Пересчет оптической плотности продукта перек- сидазной реакции в концентрацию ТС проводят по калибровочному графику.

полученному при анализе стандартного препарата ТС о . .

Пример 2о Способ осуществляют согласно примеру 1, но концентрация белка А составляет 15 мкг/мл„ Чувствительность и продолжительность анализа та же, что и в примере 1.

Предложенный способ иммунофермент- ного определения ТС обладает высокой чувствительностью 8 пг/мп (0,26 х X ), что в 8 раз вьте чувствительности, указанной в прототипе о Общая продолжительность анализа составляет 2 ч АО мин, что меньше вре- мени проведения всех известных способов иммуноферментного определения ТС о

Положительным отличием предлагае- мого способа является выделение гам- маглобулинов из :ыворотки аити-ТС непосредственно в лунках планшета с помощью аффинной адсорбции на белке А Положительный зффект за счет использования белка А предположи- тельно обусловлен как пространственным разделением антител с носителем, так и энергетически выгодной дпя взаимодействия с ТС ориентацией несущих активные центры FaЪ-фpaг eь тoв антител, связанных с белком А черС Fc-фрагменты и имеющих большую подвижность, чем при многоточечном контакте молекул с поверхностью косите- ля при прямой адсорбции, Ланный подход удобен методически и позволяет избегать вьщеления иммуноглобулинов путем осаждения, что, как правило, приводит к потере части антител.

Время анализа 2 ч 40 мин. Чувствительность определения 8 пг/мл

Формула изобретения

Способ определения тестостерона в биологической жидкости путем обработки полимерного носителя антителами, инкубации исследуемой жидкости с конъюгатом тестостерона и фермента с последующим добавлением субстрата фермента и регистрацией содержания продукта ферментативной реакции по оптической плотности, отличающийся тем, что, с , целью повышения чувствительности,ускорения и упрощения способа, полимерный носитель предварительно обрабатывают белком А до насыщения.

Изобретение относится к иммунологическому анализу и представляет собой способ количественного определения тестостерона. Цель изобретения - увеличение чувствительности ускорение и упрощение способа. Для этого полимерный носитель перед сорбцией антител обрабатывают белком A S.AUREUS до насыщения. Полученный иммуносорбент используют для твердофазного иммуноферментного анализа тестостерона. Чувствительность определения 8 пг/мл. Время анализа 2 ч 40 мин.