СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АНТИФОСФОЛИПИДНЫХ АНТИТЕЛ Российский патент 1999 года по МПК G01N33/544 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к способу определения антифосфолипидных антител, и может быть использовано в биологии и медицине для определения антифосфолипидных антител в сыворотке крови человека при акушерских осложнениях (невынашивании беременности, токсикозах, внутриутробной задержке развития плода), ревматических заболеваниях (системной красной волчанке, системной склеродермии, ревматоидном артрите и др.), ряде заболеваний центральной нервной системы, злокачественных новообразованиях, лимфопролиферативных синдромах, при острых и хронических вирусных, бактериальных и паразитарных инфекциях (инфекционном мононуклеозе, туберкулезе, сифилисе, болезни Лима, СПИДе и др.).

Известен способ определения антифосфолипидных антител, заключающийся в том, что фосфолипиды диспергируют в дистиллированной воде с помощью ультразвукового дезинтегратора, фосфолипидную суспензию адсорбируют на поверхность лунок полистирольных микропланшетов при 50^oC, планшеты обрабатывают 0,01М фосфатно-солевым буферным раствором, pH 7,2 (ФСБР), содержащим 2% бычьего сывороточного альбумина (БСА); планшеты инкубируют с сывороткой крови, разведенной 1:16 в ФСБР, содержащем 0,5% БСА и 0,05% твина-20 в течение 30 мин; планшеты промывают 3 раза ФСБР, содержащим 0,05% твина-20, и инкубируют с коньюгатом кроличьих поликлональных антител против иммуноглобулинов человека (IgM или IgG) с пероксидазой хрена, разведенным 1:2000 в ФСБР, содержащем 0,5% БСА и 0,05% твина-20, в течение 50 мин; планшеты промывают 5 раз ФСБР, содержащим 0,5% твина-20, и вносят в лунки субстратно-хромогенный раствор, содержащий тетраметилбензидин и перекись водорода, через 15 мин измеряют оптическую плотность каждой лунки при 450 нм [1].

Это методическое решение является наиболее близким к списываемому по технической сущности. Главным недостатком описанного метода является его недостаточно высокая чувствительность. К числу недостатков также следует отнести необходимость приготопления сенсибилизированных антигеном планшетов непосредственно перед проведением анализа из-за нестабильности фосфолипидов при хранении, применение высокой температуря (50^oC) для адсорбции фосфолипидов на планшеты, применение детергента в буферах для промывания планшетов и разведения исследуемых образцов и коньюгата, использование поликлональных антител для детекции антифосфолипидных антител, что приводит к недостаточно высокой чувствительности, точности и воспроизводимости определения и обуславливает также высокую вероятность неспецифического связывания реагентов.

Технической задачей изобретения является появление чувствительности определения антифосфолипидных антител. Эта задача решается описываемым способом определения антифосфолипидных антител, заключающимся в диспергировании фосфолипидов в водной среде, содержащей криопротектор в весовом соотношении 1:1-1:3 с массой фосфолипида, адсорбции фосфолипидов на полистирольные планшеты при 30-40^oC, обработке планшетов водным буферным раствором (pH 7,4±0,2), содержащим 0,5-2% инертного белка, желатина или бычьего сывороточного альбумина, инкубировании планшетов с сывороткой крови, разведенной в соотношении 1:20-1:60 по объему в водном растворе инертного белка с концентрацией 0,5-1%, промывании планшетов до и после инкубации водным буферным раствором, использовании для детекции антифосфолипидных антител конъюгата моноклональных антител против иммуноглобулинов человека с пероксидазой хрена и субстратно-хромогенной смеси, содержащей о-фенилендиамин и перекись водорода.

Практически способ осуществляется следующим образом.

15-20 кг фосфолипида диспергируют в 100 мл дистиллированной воды, содержащей в качестве криопротектора сахарозу в весовом соотношении 1:1 - 1:3 с массой фосфолипида, с помощью ультразвукового дезинтегратора при частоте 22 кГц и силе тока 5А в течение 3 мин. Полученную суспензию адсорбируют на полистирольные микропланшеты, 50 мкл на лунку, при 30-40^oC в течение (18±2) ч. Планшеты промывают 4 раза ФСБР и обрабатывают раствором инертного белка желатина или БСА, в ФСБР с концентрацией 0,5-2%, 100 мкл на лунку, при комнатной температуре в течение 2 ч, промывают 4 раза ФСБР и инкубируют с исследуемыми образцами сыворотки крови, разведенными в объемном соотношении 1: 20-1: 60 ФСБР, содержащим 0,5-1% инертного белка, по 75 мкл на лунку, при (20±2)^oC на шейкере в течение 60-30 мин. После 4-кратного промывания ФСБР планшеты инкубируют с раствором конъюгата мышиных моноклональных антител против иммуноглобулинов человека IgM или IgG с пероксидазой хрена в разведении 1:30000-1:100000 в ФСБР, содержащем 0,5-1% инертного белка, по 50 мкл на лунку, при (20±2)^oC на шейкере в течении 60 мин. После 4-кратного промывания ФСБР в лунки добавляют субстратно-хромогенный раствор, содержащий о-фенилендиамин и перекись водорода, и через 15 мин измеряют оптическую плотность при 492 нм.

Отличительной особенностью предлагаемого способа является то, что диспергирование фосфолипидов проводится в водном растворе, содержанием криопротектор в весовом соотношении 1:1 - 1:3 с массой фосфолипидов, адсорбцию фосфолипидной суспензии на полистирольные микропланшеты проводят при 30-40^oC, планшеты инкубируют с сывороткой, разведенной в объемных соотношениях 1:20 - 1: 60 водным буферным раствором без добавления детергента, содержащим только инертный белок, промывку планшетов до и после инкубаций проводят водным буферным раствором без детергента, для детекции антифосфолипидных антител использует конъюгаты мышиных моноклональных антител против иммуноглобулинов человека (IgM, IgG) с пероксидазой хрена и субстратно-хромогенную смесь, содержащую о-фенилендиамин и перекись водорода, измерение оптической плотности в лунках проводят при 492 нм. В соответствии с описываемым способом стадию диспергирования фосфолипидов необходимо проводить в присутствии криопротектора, адсорбцию фосфолипидов на планшеты необходимо проводить в интервале 30-40^oC, тестируемую сыворотку разводить в объемных соотношениях 1:20 - 1:60 водным буферным раствором без детергента, содержащим только инертный белок, промывку планшетов до и после инкубации проводить водным буферным раствором без детергента для достижения технического результата. Предпочтительно в качестве фосфолипидов использовать фосфатидилхолин и фосфатидилэтаноламин, выделенные из куриного желтка, фосфатидилсерин и сфингомиелин, выделенные из мозга быка, кардиолипин, выделенный из сердца быка и фосфатидилинозитол, выделенный из дрожжей. Предпочтительно проводить диспергирование фосфатидилэтаноламина в водном растворе с криопротектором, дополнительно содержащем 1% уксусной кислоты.

Пример 1 (контрольный по прототипу). 17 мг яичного фосфатидилхолина диспергируют в 100 мл дистиллированной воды. Полученную суспензии адсорбируют на полистирольный микропланшет при 50^oC. Планшеты промывают 3 раза ФСБР, содержащим 0,05% твина-20 (ФСБР-твин). Планшеты обрабатывают 2%-ным раствором БСА в ФСБР. Планшеты промывают 3 раза ФСБР-твин. Исследуемые сыворотки крови разводят 1: 16 в ФСБР, содержащим 0,5% БСА и 0,05% твина-20 (ФСБР-БСА-твин), инкубируют в течение 30 мин при комнатной температуре. Планшеты промывают 3 раза ФСБР-твин. Конъюгат мышиных моноклональных антител против IgM человека с пероксидазой хрена разводят в ФСБР-БСА-твин 1:100000, инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин, промывают 5 раз ФСБР-твин, инкубируют с субстратно-хромогенным раствором.

Пример 2. 17 мг яичного фосфатидилхолина диспергирует в 100 мл дистиллированной воды, содержащей 34 мг сахарозы с помощью ультразвукового дезинтегратора. Полученную суспензии ФХ адсорбируют на полистирольный микропланшет при 37^oC. Планшет промывают 4 раза ФСБР и обрабатывают 2%-ным раствором БСА в ФСБР. Планшет промывают 4 раза ФСБР и инкубируют с исследуемыми образцами сыворотки крови, разведенными 1:50 в ФСБР, содержащем 0,5% БСА(ФСБР-БСА), в течение 80 мин. После 4-кратного промывания ФСБР планшеты инкубируют с раствором конъюгата мышиных моноклональных антител против IgM человека с пероксидазой хрена в разведении 1:100000 в ФСБР-БСА в течение 60 мин. После 4-кратного промывания ФСБР планшеты инкубируют с субстратно-хромогенным раствором.

Пример 3. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 2, за исключением того, что планшеты обрабатывают 0,5%-ным раствором желатина в ФСБР, этот же раствор использует для разведения исследуемых сывороток и конъюгата мышиных моноклональных антител против иммуноглобулинов человека IgM.

Пример 4. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 3, за исключением того, что в качестве конъюгата используют конъюгат мышиных моноклональных антител против иммуноглобулинов человека IgG с пероксидазой хрена в разведении 1:50000.

Пример 5. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 3, за исключением того, что в качестве фосфолипида используют яичный фосфатидилэтаноламин, а при его диспергировании в водный раствор с криопротектором добавляют уксусную кислоту в количестве 1%.

Пример 5.1. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 3, за исключением того, что в качестве фосфолипида используют фосфатидилсерин, выделенный из мозга быка.

Пример 6. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 3, за исключением того, что в качестве фосфолипида используют сфингомиелин, выделенный из мозга быка.

Пример 7. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 3, за исключением того, что в качестве фосфолипида используют кардиолипин, выделенный из сердца быка.

Пример 8. Анализ проводят аналогично способу, описанному в примере 3, за исключением того, что в качестве фосфолипида используют фосфатидилинозитол, выделенный из дрожжей.

Описываемый способ обеспечивает в 1,5-2 раза более высокую чувствительность определения антифосфолипидных антител по сравнению со способом-прототипом. Из данных таблиц 1, 2, 3 и 4 видно, что описываемый способ по сравнению с другими вариантами обеспечивает более низкие значения оптической плотности для буферного раствора и отрицательных образцов, не содержащих антифосфолипидные антитела, и более высокие значения оптической плотности для положительных исследуемых образцов, а следовательно, обеспечивает более высокое соотношение оптической плотности исследуемого образца к оптической плотности отрицательного контроля и более высокую чувствительность и точность определения антифосфолипидных антител в сыворотке крови.

Применение описываемого способа дает возможность получения хороших результатов по определению антифосфолипидных антител при хранении готовых микропланшетов до 6 месяцев за счет: 1) использования значительно более насиженных фосфолипидов, менее подверженных окислению, по сравнении с прототипом, 2) применения более низких температур для адсорбции фосфолипидов на микропланшеты и 3) применения криопротекторов, позволяющих значительно повысить сохранность структуры липидного бислоя, а также самих липидов при длительном хранении. Кроме того, применение конъюгата моноклональных антител (вместо конъюгата поликлональных антител) с пероксидазой хрена для детекции антифосфолипидных антител позволяет существенно повысить чувствительность, специфичность и точность определения. Таким образом, описываемый способ позволяет существенно повысить качество определения антифосфолипидных антител в сыворотке крови, которое включает в себя улучшение таких параметров как чувствительность, специфичность, точность определения и воспроизводимость результатов.

Данное изобретение может быть использовано в биотехнологии и медицине для создания диагностикумов для определения антифосфолипидных антител при различных патологических состояниях и заболеваниях.

Литература
1. Kajino T. Amer J. Reproductive Immunology.- 1991. V.25, p. 28-34. "Polyclonal activation of IgM antibodies to phospholipids in patients with idiopathic fetal growth retardation"е

Способ может быть использован в биотехнологии и медицине для определения антифосфолипидных антител при акушерских осложнениях. Фосфолипид диспергируют в водной среде, содержащей криопротектор при его весовом соотношении 1:1-1:3 с массой фосфолипида. Затем проводят адсорбцию фосфолипидной суспензии на полистирольные планшеты, при 30-40^oC. Обрабатывают планшет водным буферным раствором при pH 7,4±0,2, содержащим желатин или бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 5-20 мг/мл. Затем осуществляют инкубирование с сывороткой крови, разведенной в соотношении 1:20-1:60 по объему в указанном водном буферном растворе, содержащем желатин или БСА в концентрации 5-10 мг/мл. Промывание планшет до и после инкубации проводят водным буферным раствором. В качестве конъюгата используют конъюгат моноклональных антител против иммуноглобулина человека с пероксидазой хрена. В качестве субстратно-хромогенной смеси используют субстратно-хромогенную смесь, содержащую о-фенилендиамин и перекись водорода. Оптическую плотность измеряют при длине волны 492 нм. При этом на стадии диспергирования в качестве фосфолипида используют фосфатидилхолин куриного желтка, или фосфатидилэтаноламин куриного желтка, или фосфатидилсерин мозга быка, или сфингомиелин мозга быка, или кардиолипин сердца быка, или фосфатидилинозитол дрожжей. При диспергировании фосфотидилэтаноламина в водную среду с криопротектором добавляют уксусную кислоту до конечной концентрации 10 мг/мл. Способ прост, информативен, его применение позволяет получить достоверные результаты при хранении готовых планшетов до 6 месяцев. 2 з.п.ф-лы, 4 табл.

1. Способ определения антифосфолипидных антител, включающий диспергирование фосфолипида в водном растворе, адсорбцию фосфолипидной суспензии на полистирольные планшеты при повышенной температуре, инкубацию планшет с разведенной сывороткой, промывку планшет водным раствором, инкубацию планшет с конъюгатом антител против иммуноглобулина человека с пероксидазой хрена, промывку планшет водным раствором, инкубацию с субстратно-хромогенной смесью и измерение оптической плотности, по значению которой определяют антифосфолипидные антитела, отличающийся тем, что диспергирование фосфолипида проводят в водной среде, содержащей криопротектор при его весовом соотношении 1 : 1 - 1 : 3 с массой фосфолипида, адсорбцию фосфолипидной суспензии на полистирольные планшеты проводят при 30 - 40^oC, которые затем обрабатывают водным буферным раствором при рН 7,4 ± 0,2, содержащим желатин или бычий сывороточный альбумин (БСА) в концентрации 5 - 20 мг/мл, планшеты инкубируют с сывороткой крови, разведенной в соотношении 1 : 20 - 1 : 60 по объему в указанном водном буферном растворе, содержащем желатин или БСА в концентрации 5 - 10 мг/мл, промывание планшет до и после инкубации проводят водным буферным раствором, в качестве конъюгата используют конъюгат моноклональных антител против иммуноглобулина человека с пероксидазой хрена, в качестве
субстратно-хромогенной смеси используют субстратно-хромогенную смесь, содержащую о-фенилендиамин и перекись водорода, а оптическую плотность измеряют при длине волны 492 нм. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что на стадии диспергирования в качестве фосфолипида используют фосфатидилхолин куриного желтка, или фосфатидилэтаноламин куриного желтка, или фосфатидилсерин мозга быка, или сфингомиелин мозга быка, или кардиолипин сердца быка, или фосфатидилинозитол дрожжей. 3. Способ по п.2, отличающийся тем, что при диспергировании фосфотидилэтаноламина в водную среду с криопротектором добавляют уксусную кислоту до конечной концентрации 10 мг/мл.