Штамм гибридных культивируемых клеток животных MUS мUSсULUS L. - продуцент моноклональных антител против белка р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота Советский патент 1991 года по МПК C12N5/00 C12P21/08 

Изобретение относится к гибридом- ной технологии и может быть использовано в биологии и ветеринарии для иммуноиндикации вируса лейкоза крупного рогатого скота (КРС).

Целью изобретения является получение штамма гибридомных клеток, продуцируюгдег,) моноклональные антитела (монАТ) против белка р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота, относящиеся к субклассу IgG2b.

Штамм BLV-p24-V1, ВСКК/П/ №225Д- получают следукчиим образом.

В-лимАоциты из селезенки иммун- . ных мышей линии Balb/c гибридизируют с помощью 50%-ного раствора полиэти- леигликоля 1550 по общепринятой методике с клетками мышиной миеломы P3x63Ag8.653 Преднарительно мышей иммунизируют трижды лизированным вирусом лейкоза КРС по 80 мкг внутрн

СП СП

3

адъювлитом Френнд

ОрюшИПНО С 11ОГ1НЫМ

еженедельно.

Бус торное введение в хвостопую вену 50 мкг белка проводят через месяц после третьей иммуниза дни .

R-клетки селе }енки мыши выделяю методом аффинной хроматограЛин на онове F(ab -фрагментов, иммобилизованных на сефлдекс G - 200.

В результате тестирования методо иммунофермеьт ого анализа (ИФА) полученных гибридных культур по признку продукции антител против бепка р24 вируса псикоза КРС и последующего их клонирования отобран штамм, продуцирующий монЛТ протип белка вируса гтейкоча ICPC.

ИФЛ проводят по следующей схеме.

Вирус лейкоза КРС в карбонатном- биклрбонатном буфере при рН 9,6 с концентрацией 1 мкг/мл в объеме 100 мкл вносят в лупки полистироловых планшетов. Адсорбцию проводят в течение 18 ч при 4°С. Лунки отмывают АоссЪатным буфером, рН 7,4, с 0, 1 Nad (ФБ) и с 0,05% Твин-20 (ТФБ). Затем в лунки добавляют по 100 мкл мствора ФБ, содержащего 1% альбумина бычьей сыворотки (БСА), инку- 5. руют 1 ч при чомнатной температур и отмывают несколько раз. Затем в лунки добавлмот по 100 мкл асцит- ной жидьости в разведении 1:10 - 1:8192 с ТсгЧ - БСА инкубируют 1 ч ри 37 С, ошпвают ТФБ. Вносят в лунки по 100 мкг конъюгата (кроличьи антитела против иммуноглобулинов мы:ии,меченные пероксидазой, НИИЭМ им. М.Л.Гамалеи АМН СССР) в разведении 1: 1000 и инкубируют 1 ч при 37 С. После 4-5-разовой промывк ТФБ вносят по 100 мкл субстрата ABTS. Через 30 мин реакцию останавливают добавлением 100 мкд 2%-ного раствора лимонной кислоты, определя оптическую плотность при 416 нм. Анализ данных показал, что монАТ реагируют с вирусом лейкоза КРС, титр антител составляет 2048 для асцитных жидкостей.

В качеств положительного контроля используют иммунную сыворотку мышей KRLV, а в качеств отрицательнго контроля - сыворотку интактных мышей и супернатант миепомы, не продуцирующей иммуноглобулины.

Штамм характеризуемся следующими свойствами.

5

0

5

0

5

0

5

0

5

КЦРП-И культивируют на ростовой сроцс Игла в модификации Дальбекко ) с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, л . 2,5 мМ глу- тамина, 20 мМ ОугЪера HKPPS, 200 мкг/мл Iентамицина.

Культивирование проводят при 3/V п чнкубагоре с содержанием 7,5% СОл. По - .пная концентрация 105 кч/мл, Мутность рассева 1:6. Клонирован ie клеток проводят в 96-ячеечных млатах с использованием в качестве гоп ающе- го лоя макрофаго ribiiiien. С.пециЛи- ческая эффективность 3-го клонирования составляет 9Я%.

} мчоконоерряци - тгрово;,ят -ьшо- ротко жбрионов кор в с .зни- ei О7 диметилсуо1ь«Ьг ксидч, 50% сы- ор п эмбрион.,ч крупно о рогатого скога при Концрнтршли 1x10 кле- т к мп. Жизнеспособнс сть кле,ок паима после размораживания состав- зпет 80.

Прививка по 10б клеток штамма .Y-p24-Vl сингенным предобработанным мьпчам вызывает у них образован ie асцитпой опухопи, сопровож/1ающреся ьыделением асцнтноп жидкости г ко личесгве 1-5 мл. В асцитнон жидкости содержатся специфические монАТ к Оелку р24 вируса пейкоза КРС. Способность продуцировать монА 1 клетками ьчтамма BLV-p24-Vl сохранялась на протяжении 4 нес непрерывного ю тьтивирования клеток in vitro. После размораживания клетки сохраняют способнссть продуцировать ионАТс Прививка кк нам клеток на р ,- HIix пассажах культивирования стабильно вызывает образование у них асцитных опухолей.

Для выделения из асцитнои жидкости иммуноглпбутины осаждаю cvjibftaTOM аммония до 50/ насыщения. Осадок отделяют ценiрифугироьанием, диал 1зуют, после чего про во 1,ят фра;с- ционирование через сефадекс 0-150.

Из 1 мл асцитной жидкости после осажденгя белков сульфатом аммония получают 7 мг монАТ. Титр антител в асцитной жидкости, установленный с л&мощью иммуноферментного метода, составляет 2048.

Субкласс монАТ определяют с помощью коммерческих антисубклагсовых Л сывороток методом иммунодиффузии в агаровом геле. МонАТ KT -p24-V1 принадлежат к субклассу 1р,С,2Ъ

5ir,

Для подтверждения специфичности монЛТ к р24 BT.V используют также МР.ТОДЫ иммунсанализа в пятнах (dot) на нитроцеллюдозной мембране и Вес- терн-блотинга. Одновременно это является примерами использования монАТ BLV-p24-V1 для иммуноиндикации бел- Ki p 2 4.

Пример 1. Игтуноанализ в пятнах на нитроцеллюлозной мембране.

На вырезанные полоски нитроцел- люлознон мембраны с диаметром пор 0,45 мкм, величиной 5x5 мм наносят 1 мкл белка р24 вируса лейкоза КРС в концентрации 0,1 мг/мл, высушивают и помещают в пупки полистироловой пластины для ИФА. Затем в лунки вносят 100 мкл блокирующего буфера, состоящего из ФБ, содержащего 3% альбумина сыворотки крови быка, инкубируют 30 мин при комнатной температуре, промывают ФБ и инкубируют с 50 мкл асцитной жидкости в разведении от 1:4 до 1:4096 в течение 2 ч при комнатной температуре во влажной камере. Затем промггоают ФБ и вторично инкубируют с блокирующим буфером на протяжении 30 мин при комнатной температуре. Затем в лунки вносят по 100 мкл конъюглта в разведении 1:1000 в блокирующем буфере, инкубируют 2 ч при комнатной температуре, отмывают и вносят по 100 мкл приготовленного субстрата о-дианизидина (0,5 мг/мл о-дианизидина, 0,5 М Трис-НС1, рН 7,5, 2 мкл/мл 30% НгПг). Реакцию останавливают дистиллированной водой.

Окрашивание оценивают визуально.

Результаты свидетельствуют о взаимодействии монАТ BLV-p24-V1 с очищенным белком р24 вируса лейкоза КРС. i

П р и м е р 2. Применение монАТ BLV-p24-V1 в методе Вестерн-блотнн- га.

Для проведения иммунного блотинга 100 мг вирусного материала или 8 мкг белка р24 фракционируют в ДСКа- ПААГ в стандартной трис-глициновой системе. Электроперенос белков на нитроцеллюлозную мембрану (НМ) .с диаметром пор 0,45 мкм проводят при

10

75576

JO R л течение 1Н ч. После -жои- чания ллектрофорезл гель вммлчтмют в течение 30 мин в биллетн.члиропанной поде. Для иммуноиндикацни ков на НМ используют иммуппфермент- ный метод. Для этого ММ просушивают и инкубируют в течение 2 ч при 37 С в блокирующем буфере (0,01 М трис- НС1, рН 7,5, 0,9% NaCl, 3% БСА). Затем НМ помещают в раствор с асцит- ной жидкостью в разведении от 1:4 до 1:4096 или в раствор очищенных монАТ. П качеств контроля используjr ют., сыворотку здоровых мышей. НМ инкубируют при комнатной температуре в течение ночи. Затем отмывают в течение 1,5 ч при 37°С с отмывающим буфером (0,05% трис-HCl, рН 7,5 с

20 0,05 Твин-20, 3 мМ Na2 ЭДТА нО,25М NaCl ). Затем НМ помещают в конъюгат, разведенный блокирующим буфером 1:1000, и инкубируют в течение 1,5 ч при 37°С, после чего НМ отмывают

25 отмывающим буфером в течение 1,5 ч при 37°С, помепают в раствор субстрата о-дианнзнчина, как описано выше, инкубируют в темноте при комнатной температуре до появления окJQ раски.

С целью установления неспецифического перекрестного связывания монАТ в методе Вестерн-блотннга использованы следующие контрольные антигены: альбумин сыворотки криви КРС, гемоглобин сыворотки крови КРС, лизированные лимфоциты крови здоровых коров, антигены вируса герпеса КРС типа I, коммерческие препараты ящурного антигена.

Результаты свидетельствуют о том, что монАТ BLV-p24-V1 не связывают с перечисленными антигенами. МонАТ высокоспецифично реагирует с белком

., р24 вируса лейкоза КРС.

Формула изобретения

Штамм гибридных культивируемых 5Q клеток животных Mus musculus ВСКК(П) 225 Д-продуцент моноклональных антител против белка р24 вируса лейкоза крупного рогатого скота.

40

Изобретение относится к гибри- домнон технологии и может быть использовано в биологии и ветеринарии для иммуноиндикации вируса лейкоза КРС. Цель изобретения - получение штамма гибридомных культивируемыхкпе- ток, продуцирующего моноклональные антитела (монАТ) против бечка р24 пируса дейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), относящиеся к субклассу Ip,G-2b. Ытамм потучают гибридизацией клеток селезенки мышей линии Balb/c, иммунизированных ВПКРС, с клетками миеломы мышей Balb/c РЗХбЗЛ З.653. Птлчм депонирован под номером ВСКК/П/ № 225П. Шгамм культивируют в среде /1МЕМ с добавлением 10% сыворотки эмбриона коровы, 20 мМ Ht-PES, 2,5 мМ L-глутамина, 200 мкг/мл гентамицина при 37 С и 7,5% СО в воздухе. Мтамм приминается в брюшную полость сингенных мзлгаей в виде ас- цитных опухолей. Гнбридома продуцирует монАТ класса TgG2b, специфичные к белку р24 ВЛКРС. Специфичность монАТ установлена иммунофермеитным анализом на очищенном белке р24, а также методом Вестерн-блотинга. Продуктивность штамма - около 7 мг монАТ из 1 мл асцнтной жидкости. 45 (Л