Способ определения атакуемости белка пепсином Советский патент 1989 года по МПК G01N33/68 

Изобрете1ше относится к медицине биологии и может быть использовано в агропромышленном комплексе, в частности 3 пищевой промышленности, ветеринарии, зоотехнике, а также в биотехнологии.

Цель изобретения - повышение точности, чувствительности способа, его упрощение и ускорение.

Цель достигается тем, что к раствору белка 5 приготовленному на буфер- ком растворе, поддерживающем оптимальное для реакции пепсин - белок значение рН на уровне ,8, добавляют водный раствор пепсина заведомо избыточной активности по отношению к взятому для реакции количеству белка, реагенты перемешивают и через реакционную смесь пропускают слабый высокочастотный ток постоянной силы.

По повышению напряжения в цепи электрического тока, пропускаемого 4epie3 реакционную смесь пепсин - белок, в сопоставлении с уровнем и периодом повышения напряжения в цепи, замкнутой через реакционную смесь пепсин - эталонный белок (казеин) при прочих равных условиях, определяют показатель атакуемости испытуемого белка (относительно эталонного белка), выражающийся в безразмерных единицах.

Способ осуществляют следующим образом.

Определение проводят на анализаторе ферментативной активности АФ-1, используя следующие параметры высокочастотного тока: частота 880 кГц; сила тока 20 мкА. В кювету, помещенную в термостатируемую ячейку прибора.

сд

о

00 Од

3 1508 работающую «в режиме -г-ЗУ С, вносят 1,4 мл буферного раствора с концентрацией водородных ионов (рН), равной 2pliO,8, затем добавляют туда же 0,6 мл рабочего раствора эталонного белка, например казеина, вставляют датчик с двумя электродами и подсое- длняют его к прибору.

Запись потенциала напряжения производят на диаграмной ленте самопишущего милливольтметра. Убедившись, что диаграмма параллельна направлению ;хвижения ленть, Б кювету через отверстие в датчике вводят водный раствор пепсина, 1 мл которого содержит мг кристаллического пепсина,, в количестве, большем чем требуется для расщепления данного количества белка. Запись потенциала напряжения производят до прекращения его роста. Аналогично производят запись хода ферментативной реакции пепсин - испытуемый белок. Анализируя кривые, оценивают их конфигурацию, получая при этом важную информацию об интенсивности ферментативного процесса на разных его стадиях, рассчитывают относительную глубину расщепления, относительную скорость расщепления (показатели, имеющие и важное самостоятельное значение) н атакуемость бе,лка пепсином„

АтсЗкуемость белка пепсином рассчк- тывается по

А „ г , ч - Г .

л - 1 о э о - 1-г-- UK n V. -Lо

де А атакуемость белка пепсиномj Tjj - относительная глз бина расщепления выражаемая в без- размернь х единицахg равная частному от деления величи-- ны отклонения стрелки милливольтметра при испытании опытной пробы белка h (мм) на соответствЗгНощий показатель, полученный при испытании пробь эталонного белка h к (мм)I

Ss относительная скорость расщепления бешса, выражаемая в безразмерных единицах, равная частному от деления произведения величины отклонения стрелки милливольтметра при испытании опытной

0

0

0

5

0

5

пробы белка и продолжи-- тельности 1 (мин) реакции пепсин - эталонный белок ка произведение отклонения стрелки милливольтметра при испытании контрольной пробы этало и} ого Селка h (мм) и продолжительности реакции пепсин - onbiTHbm белок l (мин),

Пример 1, Приготовляют пробы этапонного белка и испытуемого белка: 1 г мелкорастертого сухого белка помегцают в колбу и добавляют к нему 70 мл дистиллированной воды затем при помешивании туда же добавляют 10-12 мл 0,2 н, раствора едкого натрия,а затем по каллям - 10-12 мл 0,1 н. раствора соляной кислоты до рН 7,,0 Полученный основной раствор используют для приготовления рабочего раствора путем разбавления основного раствора в 0 раз цитратным буферньп раствором рН которого 2, 1 . В качестве эталонного белка используют казеин, Испьлтанию подвергался белок кормовой микробного происхождения (БЮ1П),

Определение атакуемости испь туемо- го белка пепсином проводат при помо™ Д1-: анализатора ферментативной активности АФ-1 ,

За 2 ч до исследования готовят рабочий раствор пепсина в воде, для его 20 мг кристаллического пепсина растворили в 20 мл дистиошированной водьь После вклю-чения анализатора и прогрева его в течение 30 мин при режиме термостата в кювету, установленную в гнездо теркостатаг вносят 0,6 мл рабочего раствора эталонного белка - казеина и 1,,4 мл цитратного , буферного раствора рН 2,15 затем в кювету погружают датчик с двумя электродами и подключают его к прибору« Производят пробную запись потенциала напряжения при силе тока 20 мкА, Убедив1Ш--гсь, что диаграмма параллельна налравлению Движения ленты, в кювету через отверстие в датчике вводят 0,06 мл рабочего раствора пепсина-. Запись потенциала напряжения производят после перемешивания реакционной смеси магнитной мешалкой в течение 20 Се Запись прекращают после выхода диаграммы на направлениеj параллель нов налравлению движения ленты самс515081

писца. Аналогично производили запись реакции пепсин - БКМП.

Результаты определения и расчета атакуемоети белка БКМП пепсином представлены в табл.1.

Как видно из табл.1, показатель атакуемости испытуемого белка БКМП пепсином по отношению к казеину составил 0,4986, что свидетельствует о невысоком уровне атакуемости белка микробного происхождения пепсином. При этом показатель относительной глубины расщепления составил 0,6316 а показатель относительной скорости расщепления - 0,7895.

Пример .2. Способ выполняют аналогично примеру 1, однако исследованию подвергали 10 проб казеина, отобранных из одной партии.

Параллельно были проведены исследования проб белка кормового микробного происхождения БКМП, отобранных из одной партии.

Результаты определения атакуемости белка кормового микробного происхождения (БКМП) в сопоставлении с эталонным бех/ком представлены в табл.2.

Как видно из табл.2, в серии из 10 параллельных определений атакуемости БКМП относительно казеина результаты с надежностью 95,4% предлагаемым способом можно получить с погрешностью 2,9%.

При этом показатели глубины рас- ш,еште1шя и скорости расщепления БКМП по сравнению с казеином определяются с еще меньшей погрешностью (соответственно 2,25 и 2,75%). Такой уровень погрешности измерений характеризует предлагаемый способ как достаточно точный (воспроизводимый и правильный) . Относительно невысоким уровнем характеризуются также и показатели рассеяния: сигма и коэффициент вариации, составившие для относительной скорости расщепления, относительной глубины расщепления и атакуемости БКМП соответственно 0,0364 (4,35%), 0,0238 (3,56%) и 0,0257 (4,58%).

Таким образом, предлагаемый способ по сравнению с известным имеет следующие преимущества:

высокая точность (Л% 2,9%) и чувствительность (1,8-10 белка,

10

15

20

25

30

5

0

5

0

5

676

при 6,0 - 12, г белка при использовании известного способа);

регистрация хода реакции на диаграммной ленте самописца по аналоговому типу, в результате чего активность реакции пепсин - белок можно оценить- в динамике времени в любой ее точке, что обеспечивает более высокую информативность способа определения атакуемости белка пепсином и позволяет рассчитать показатель атакуемости белка пепсином в сопоставлении с эталонным белком по предложенной формуле (А Го-So), а также обрабатывать данные при непосредственном вводе их в ЭВМ;

возможность проведения определения атакуемости пепсином микроколичеств белка (около 18 мкг белка);

сокращение продолжительности определения с 3-6 ч по известному способу до 8-12 мин по предлагаемому;

сокращение расхода пепсина (кристаллического препарата) и субстрата в 100 - 250 раз по сравнению с известным способом, что особенно важно при изучении атакуемости белка, образцы которого имеются в малых количествах;

упрощение способа, достигаемое сокращением числа этапов определения.

Формула изобретения

Способ определения атакуемости белка пепсином путем добавления к раствору испытуемого и контрольного белка водного раствора пепсина и исследования ферментативной реакции пепсин - белок, о тличающийся тем, что, с целью павьш1ения точности способа, его упрощения и ускорения, дополнительно через реакциоиную смесь в течение всей реакции пропускают высокочастотный ток постоянной силы, регистрируют динамику глубины и ско- .рости расщепления белка по повышению напряжения в цепи в опытных и контрольных пробах, а атакуемость белка пепсином рассчитывают по формуле

А Го So,

где А - атакуемость белка пепсииом;

Гр - относительиая глубина расщепления;

So - относительная скорость расщепления белка.

Таблица 1

Изобретение относится к медицине , в частности, биологии, и может быть использовано в агропромышленном комплексе, а именно в пищевой промышленности, ветеринарии, зоотехнике и биотехнологии для определения атакуемости белка пепсином. Целью изобретения является повышение точности чувствительности, информативности способа, его упрощение, сокращение длительности определения. Сущность изобретения состоит в том, что к растворам контрольного и испытуемого белков добавляют водный раствор пепсина, через реакционную смесь пропускают слабый высокочастотный ток постоянной силы и по кривым динамики повышения напряжения в цепи в опытной и контрольной пробах судят об атакуемости белка пепсином.

О

2

4

6

8

10

12

Таблица 2