ЖИДКАЯ ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ГЛУБИННОГО КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ PLESIMONAS SHIGELLOIDES ШТАММ № 16 Российский патент 2004 года по МПК C12N1/20 C12Q1/04 

Изобретение относится к области микробиологии и может быть использовано для получения микробного белка, инициирующего льдообразование.

Для глубинного культивирования бактерий Plesiomonas shigelloides штамм №16 используют известные жидкие питательные среды, например ферментативный гидролизат мяса крупного рогатого скота, ферментативный гидролизат тушек пушных зверей, кислотный гидролизат казеина, ферментативный гидролизат казеина, синтетическую жидкую питательную среду.

Известна жидкая питательная среда на основе ферментативного гидролизата тушек пушных зверей ("Способ получения основы питательных сред для культивирования микроорганизмов". МПК⁶ С 12 N 1/20, С 12 N 01/04, №2061038), имеющая в своем составе следующее соотношение компонентов, г· л^-1:

С₆Н₁₂О₆ 20

NaCl 3,0

КСl 0,2

Na₂HPO₄ 6,0

содержание аминного азота в среде (70... 120) мг %;

исходная концентрация водородных ионов (7,2±0,1) ед.рН

Общим с заявляемым решением является содержание солей калия: калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, хлористый калий. Солей натрия: натрий серноватистокислый, хлористый натрий, при следующем соотношении компонентов (г· л)^-1:

КН₂РO₄ 2,2

К₂НРO₄ 1,7

Nа₂S₂O₃ 0,6

Na₂HPO₄ 6,0

КСl 0,2

К недостаткам данной среды следует отнести нестабильность и недостаточно высокий уровень результатов по накоплению концентрации льдообразующего белка. Кроме того, эта среда, сложна в изготовлении и для ее получения используют дефицитное и дорогостоящее сырье-мясо пушных зверей, а также дорогой фермент поджелудочной железы - панкреатин.

Известна жидкая питательная среда на основе кислотного гидролизата казеина (Регламент производства вакцины чумной живой сухой №377-97, введен в действие в 1997 году), имеющая в своем составе следующее соотношение компонентов, г· л^-1:

КН₂РO₄ 2,2

К₂НРO₄ 1,7

MgSO₄ 0,6

Na₂S₂O₃ 0,6

содержание аминного азота в среде 138 мг %;

исходная концентрация водородных ионов среды 7,15 ед.рН.

Общим с заявляемым решением является наличие солей калия: калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, солей натрия и магния: сульфат магния и натрий серноватистокислый при следующем соотношении компонентов, г· л^-1:

КН₂РO₄ 2,2

К₂НРO₄ 1,7

MgSO₄ 0,6

Nа₂S₂O₃ 0,6

К недостаткам данной среды следует отнести недостаточно высокий уровень результатов по накоплению концентрации льдообразующего белка. Кроме того, эта среда сложна в изготовлении и для ее получения используют дорогостоящие реактивы и сырье, в частности соляную кислоту и молочный белок - казеин.

Известна жидкая синтетическая питательная среда (Инструкция по приготовлению и контролю вакцины ассоциированной инактивированной против колибактериоза, сальмонеллеза, клебсиеллеза и протейной инфекции молодняка сельскохозяйственных животных и пушных зверей /АО "Агровет", 1995 г.), имеющая в своем составе следующее соотношение компонентов, г· л^-1:

К₂НРO₄ 2

КН₂РO₄ 5

MgSO₄×_{7H2O 0,55}

FeSO₄×_{3H2O 0,025}

Общим с заявляемым решением является наличие солей калия: калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, соли магния - магний сернокислый семиводный, при следующем соотношении компонентов, г· л^-1:

K₂HPO₄ 2

КН₂РO₄ 0,5

МgSO₄×_{7Н2О 0,55}

К недостаткам данной среды следует отнести высокий расход 50%-ного раствора глюкозы в процессе глубинного культивирования и низкий уровень выхода биомассы. В КЖ (культуральной жидкости) вследствие этого низкий уровень центров нуклеации. Кроме того, при изготовлении этой среды используют дефицитные реактивы, в частности магний сернокислый семиводный, железо (II) сернокислое трехводное.

Наиболее близкой является жидкая питательная среда на основе ферментативного гидролизата мяса крупного рогатого скота (Регламент производства вакцины чумной живой сухой №377-97, введен в действие в 1997 году), имеющая в своем составе следующее соотношение компонентов, г· л^-1:

КН₂РO₄ 2,2

К₂НРO₄ 1,7

MgSO₄ 0,6

Nа₂S₂О₃ 0,6

содержание аминного азота в среде 140 мг %;

исходная концентрация водородных ионов среды - 7,15 ед.рН

Общим с заявляемым решением является наличие солей калия: калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, солей натрия и магния: сульфат магния и натрий серноватистокислый при следующем соотношении компонентов, г· л^-1:

КН₂РO₄ 2,2

К₂НРO₄ 1,7

MgSO₄ 0,6

Na₂S₂CO₃ 0,6

содержание аминного азота в среде 140 мг %;

исходная концентрация водородных ионов среды - 7,05 ед.рН (Регламент производства вакцины чумной живой сухой №377-97, введен в действие в 1997 году).

К недостаткам данной среды следует отнести нестабильность и недостаточно высокий уровень результатов по накоплению биомассы и концентрации льдообразующего белка. Кроме того, эта среда сложна в изготовлении и для ее получения используют дефицитное и дорогостоящее сырье, в частности ферментативный гидролизат мяса.

Ферментативный гидролизат мяса является источником азота и нативного белка, предотвращает диссоциацию микроорганизмов, калий фосфорнокислый одно и двузамещенный поддерживают буферный баланс, концентрации водородных ионов, присутствие сульфата магния и натрия серноватистокислого обеспечивает присутствие в среде ионов Мg и предотвращает деструкцию клеток.

Сущность изобретения состоит в том, что жидкая питательная среда на основе ферментативного гидролизата казеина для глубинного культивирования бактерий Plesiomonas shigelloides штамм №16, содержащая соответствующую белковую основу, наиболее оптимальный состав солей, а также концентрации аминного азота и исходной концентрации водородных ионов в среде позволяет получить прирост концентрации льдообразующего белка на уровне:

4,65× 10¹⁰ ц.н.× см^-3;

4,74× 10⁹ ц.н.× см^-3;

4,62× 10¹⁰ ц.н.× см^-3.

Указанный технический результат при осуществлении изобретения достигается вследствие того, что жидкая питательная среда для глубинного культивирования бактерий Plesiomonas shigelloides штамм №16, содержащая соли: калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат магния, натрий серноватистокислый, в качестве основы питательной среды содержит ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 138 мг % и исходной концентрацией водородных ионов 7,2 ед. рН при следующем содержании компонентов, г/л:

КН₂РО₄ 2,2

К₂НРO₄ 1,7

MgSO₄ 0,6

Na₂S₂O₃ 0,6

ферментативный

гидролизат казеина остальное

Удешевление среды достигается заменой дорогостоящего ферментативного гидролизата мяса и использованием вместо него более дешевого сырья - ферментативного гидролизата казеина. Сравнительная стоимость 1 дм³ готовой среды приведена в таблице 1.

Сохранение ростовых свойств питательной среды обусловлено наличием в питательной основе сбалансированного состава углеводов и минеральных солей.

Культивирование бактерий вида Plesiomonas shigelloides штамм №16 осуществляют в биологическом реакторе, в режиме постоянного перемешивания и аэрации. Предлагаемая среда содержит легкодоступное сырье и реагенты отечественного производства, проста в изготовлении и обеспечивает высокий выход концентрации микробного белка активного по ЛОА (льдообразующей активности). Под воздействием ингредиентов предлагаемой питательной среды улучшается структура клеточных мембран, возрастает потребление веществ из питательного раствора, улучшается обмен веществ за счет непосредственного воздействия на ферментные системы клеток, окислительно-восстановительные процессы, предотвращаются явления самоагглютинации и лизиса бактериальных клеток на завершающих этапах культивирования, увеличивается устойчивость бактериальных клеток к резким колебаниям исходной концентрации водородных ионов в среде. Ингредиенты среды способны связывать бактериальные токсины, продукты клеточного метаболизма, продукты распада отмирающих клеток. Выбранная белковая питательная основа обладает значительно большей питательной ценностью для этого вида бактерий и легче усваивается. Кроме того, компоненты питательной среды в их оптимальном соотношении предотвращают образование плотного осадка при длительном хранении готовой продукции, в частности полученной НК (нативной культуры) при ее осаждении. Все вышеперечисленное позволяет получить НК (нативную культуру) с достаточно высокими результатами по накоплению прироста концентрации льдообразующего белка, по сравнению с прототипом и с более высоким содержанием живых клеток, имеющих на внешней мембране активный белковый компонент.

Выбор питательной среды, концентрация аминного азота, концентрация водородных ионов, продолжительность культивирования определены опытным путем на основании данных результатов культивирования в колбах вместимостью 250 см³ на шуттель-аппарате и в результате выращивания в аппаратах фирмы "Marubishi" модели МД-400 вместимостью 0,007 м³.

При подготовке посевного материала (СПРК-стабилизированного препарата рабочей культуры), (ПРК-производственной рабочей культуры), сухой лиофильновысушенной культуры в ампулах и флаконах, при выращивании на колбах вместимостью 250 см³ и в аппаратах вместимостью 0,007 м³, обнаружения и отбора колоний была использована стандартная бактериологическая методика, заключающаяся в проращивании колоний исследуемого штамма на плотной питательной среде (основа - ферментативный гидролизат мяса крупного рогатого скота), с последующим пересевом в жидкую питательную среду во флаконы (основа - ферментативный гидролизат мяса крупного рогатого скота), а затем на скошенной плотной питательной среде в матрацах (основа - ферментативный гидролизат мяса крупного рогатого скота). Полученная агаровая культура смывалась определенным раствором, стабилизирующей жидкостью и защитной средой в зависимости от цели приготовления и использования посевного материала. В получаемых на определенных стадиях посевных культурах содержание посторонней микрофлоры не допускается.

В результате проведения плановых экспериментов по культивированию бактерий Plesiomonas shigelloides штамм №16 в колбах вместимостью 250 см³ на шуттель-аппарате были получены следующие данные. Был установлен максимальный показатель прироста концентрации льдообразующего белка при содержании в жидкой питательной среде аминного азота на уровне 138 мг% и выращивании культуры в течение (18... 30) часов независимо от исходной концентрации водородных ионов в жидкой питательной среде в интервале от (6,8... 7,7) ед.рН. В процессе выращивания в асептических условиях производился отбор проб в определенные планом эксперимента часы роста.

В отобранных пробах определялись такие основные показатели как:

ОК (оптическая концентрация млрд микр.кл.× см^-1);

БК_ч (биологическая концентрация на чашках Петри млрд живых микр.кл.хсм^-1);

ЛОА (льдообразующая активность в ц.н.× см^-3);

рН (концентрация водородных ионов, ед.рН);

наличие посторонней микрофлоры (присутствие или отсутствие).

На основании изучения результатов экспериментов наиболее высокие значения по ЛОА (льдообразующей активности) были получены: при культивировании в колбах (питательная основа - ферментативный гидролизат казеина - N_ам - 138 мг %; рН - 7,0 ед.) 6,82× 10⁹ ц.н.× см^-3, в сравнении с жидкой питательной средой на основе ферментативного гидролизата мяса и кислотного гидролизата казеина.

Показатели льдообразующей активности для этих сред составили: питательная основа - ферментативный гидролизат мяса (льдообразующая активность - 6,93× 10⁴ ц.н.× см^-3; N_ам. - 146 мг %; рН - 7,1 ед.).

Питательная основа кислотный гидролизат казеина (льдообразующая активность - 3,79 ц.н.× см⁴; N_ам - 146 мг %; рН - 7,0 ед.).

При уменьшении продолжительности культивирования в жидкой питательной среде на основе ферментативного гидролизата казеина (N_ам - 138 мг %, рН среды - 7,15 ед.) были получены показатели по льдообразующей активности - 5,50× 10⁹ ц.н. × см^-3 и 1,25× 10⁹ ц.н.× см^-3.

В сравнении с жидкой питательной средой на основе ферментативного гидролизата мяса (N_ам – 140 мг %, рН среды - 7,7 ед.) показатель льдообразующей активности составил 1,38× 10⁶ и 5,29× 10⁷ ц.н.× см^-3). ОК (оптическая концентрация млрд микр.кл.× см^-1) определялась путем разведения образца культуры 0,9%-ым раствором натрия хлорида и сравнения результата с оптическим стандартом на 10 единиц мутности ГИСК им. Л.А.Тарасовича. БК_ч (биологическая концентрация млрд живых микр.кл.× см^-1) определяли с помощью стандартной бактериологической методики путем высева на чашки Петри с плотной питательной средой (основа ферментативный гидролизат мяса). Наличие посторонней микрофлоры регистрировалось при помощи окрашенных по Грамму мазков, которые используют для оценки чистоты бактериальной массы. Реакцию культуральной среды определяли при помощи иономера универсального. Показатель льдообразующей активности учитывается путем проведения анализа на миникриостате МК-70 с регулируемой температурой.

Пример. Жидкую питательную среду для культивирования бактерий Plesiomonas shigelloides штамм №16 готовят следующим образом. В варочный котел наливают расчетное количество дистиллированной воды и гидролизата до содержания аминного азота (145±15) мг %. Компоненты перемешивают, кипятят до полного исчезновения хлопьевидного осадка и отбирают пробу для контроля и корректировки величины аминного азота (138±2) мг %. В случае необходимости добавляют воду или гидролизат, анализ повторяют. Добавляют навеску солей и кипятят до полного растворения солей, после чего отбирают пробу для контроля и корректировки величины концентрации водородных ионов в среде в пределах (7,1±0,1) ед.рН. Корректировку рН проводят 10%-ным раствором НСl или NaOH.

Горячую среду фильтруют через картон марки "Т" на нутч-фильтре Ф-52, фасуют во флаконы вместимостью 0,1 дм³ по (50±5) см³ и бутыли вместимостью 20 дм³ по (10±0,5) дм³. После фильтрации проводят контроль среды. Флаконы закрывают ватно-марлевыми пробками. В каждую бутыль вместимостью 20 дм³ со средой вводят пеногаситель ВМ-5 (пропись №5, регламент производства вакцины чумной живой сухой №377-97, введен в действие в 1997 году) из расчета 1 см³×^{л-1. Бутыль оборудуют соответствующей оснасткой. Нормируемое время операции составляет (1,5…2) ч.}

Контроль среды. Жидкая питательная среда по внешнему виду представляет собой жидкость темно-желтого цвета, не содержащую посторонних включений, допускается небольшой осадок. По своим физико-химическим свойствам она должна удовлетворять следующим требованиям:

содержание аминного азота, мг % - 120±10 (определяют при приготовлении бульона, операция ТП-5-1, регламент производства вакцины чумной живой сухой №377-97, введен в действие в 1997 году);

концентрация водородных ионов, ед.рН - 7,1±0,1.

Методы контроля изложены в разделе 13 (Регламент производства вакцины чумной живой сухой №377-97, введен в действие в 1997 году).

При выполнении контроля следует руководствоваться требованиями, изложенными в "Сборнике инструкций по технике безопасности". Нормируемое время операции составляет 0,5 ч (Регламент производства вакцины чумной живой сухой №377-97, введен в действие в 1997 году).

Операция ТП-5-4. Стерилизация (Регламент производства вакцины чумной живой сухой №377-97, введен в действие в 1997 году).

Флаконы и бутыли со средой стерилизуют в автоклаве по режиму: температура (120... 125)° С, экспозиция (30... 35) мин. Стерильная питательная среда может храниться при температуре (18... 25)° С не более 15 суток. При температуре (2... 6)° С не более 30 суток. При стерилизации среды необходимо руководствоваться требованиями, изложенными в "Сборнике инструкций по безопасности". Нормируемое время операции составляет 3, регламентируемое 0,5 ч (Регламент производства вакцины чумной живой сухой №377-97, введен в действие в 1997 году).

Стерильная питательная среда оценивается только по внешнему виду, который должен соответствовать следующим требованиям: жидкость темно-желтого цвета с опалесценцией при введенном пеногасителе, не содержащая посторонних включений, допускается небольшой осадок. Внешний вид оценивают путем визуального просмотра укупорок со стерильной питательной средой. Нормируемое время операции составляет 0,5 ч.

При получении посевных культур бактерий Plesiomonas shigelloides штамм №16 для глубинного культивирования в аппаратах вместимостью 0,007 м³ используют бактериологическую методику, описанную выше для колб, вместимостью 250 см³. В получаемых на определенных стадиях посевных культурах наличие посторонней микрофлоры не допускается. Полученная посевная культура на плотной питательной среде (питательная основа - ферментативный гидролизат мяса) в чашках Петри должна иметь оптическую концентрацию, после окончания инкубационного периода при смыве 0,9%-ным раствором хлорида натрия не менее 1× 10⁹ млрд микр.кл.хсм^-1, в поле зрения мазка не должно содержаться ни одной посторонней клетки. Посевная культура, полученная в жидкой питательной среде во флаконах (питательная основа - ферментативный гидролизат мяса), должна иметь оптическую концентрацию после окончания инкубационного периода, не менее 1× 10⁹ млрд микр.кл.× см^-1, в поле зрения мазка не должно содержаться ни одной посторонней клетки. Посевная культура, полученная в результате смыва со скошенной плотной питательной среды в матрацах (питательная основа - ферментативный гидролизат мяса), должна иметь оптическую концентрацию после окончания инкубационного периода, не менее 1× 10¹¹ млрд микр.кл.хсм^-1, в поле зрения мазка не должно содержаться ни одной посторонней клетки. Культуральную жидкость, удовлетворяющую указанным выше требованиям, используют как посевной материал для ферментера МД-400, вместимостью 0,007 м³. Культивирование проводят в среде, приготовленной на основе ферментативного гидролизата казеина с N_ам. - 138 мг % и исходной рН среды - 7,2 ед. После введения глюкозы и в течение всего процесса выращивания корректировку рН проводят путем добавления 20%-ного водного раствора аммиака и 43%-ного раствора глюкозы. Культивирование проводят при постоянном механическом перемешивании и аэрации из расчета 0,1 об. (об.· мин)^-1.

В процессе выращивания отбирают в асептических условиях пробы и определяют основные биологические показатели. Перечень определяемых показателей и методы их определения описаны выше при культивировании бактерий Plesiomonas shigelloides штамм №16 на колбах вместимостью 250 см³ на шуттель-аппарате.

По окончании культивирования полученная НК (нативная культура) должна отвечать следующим требованиям:

концентрация льдообразующих ядер, активных при температуре минус 9° С, ц.н.× см^-3 - не менее 1× 10⁹;

оптическая концентрация, (ОК) млрд микр.кл.× см^-1 - не менее 10;

биологическая концентрация при выращивании на чашках Петри (БК_ч), млрд жив.микр.кл.× см^-1 - не менее 3;

концентрация водородных ионов, ед.рН - в диапазоне 6,6... 7,6;

содержание посторонней микрофлоры - не допускается.

По окончании процесса выращивания проводят контроль чистоты полученной биомассы путем микроскопии мазков, окрашенных по Грамму, путем высева в пробирки со скошенной плотной питательной средой на основе ферментативного гидролизата мяса, а также на чашки Петри с плотной питательной средой на основе ферментативного гидролизата мяса.

Одновременно с этим определяли такие основные биологические показатели, как:

оптическая концентрация, (ОК) - млрд микр.кл.× см^-1;

биологическая концентрация при выращивании на чашках Петри (БК_ч) - млрд жив.микр.кл.× см^-1;

ЛОА (льдообразующая активность) - ц.н.× см^-3;

концентрация водородных ионов - ед.рН;

наличие посторонней микрофлоры (присутствие или отсутствие).

Таким образом, использование жидкой питательной среды на основе ферментативного гидролизата казеина позволяет получить бактериальную массу с достаточно высоким уровнем прироста концентрации льдообразующего белка. Эта среда может быть использована для культивирования бактериальной массы широкого круга микроорганизмов. Использование предлагаемой среды позволяет упростить состав среды и удешевить технологию ее получения путем замены дорогостоящего и дефицитного ферментативного гидролизата мяса крупного рогатого скота на ферментативный гидролизат казеина.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано при получении микробного белка. Питательная среда в качестве основы содержит ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 138 мг %, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат магния, натрий серноватистокислый, исходная концентрация водородных ионов 7,2 ед. рН. При выращивании бактерий Plesiomonas shigelloides штамм №16 - продуцента льдообразующего белка, последний позволяет получить прирост концентрации белка на уровне 6,82·10⁹ ц.н.·см^-3. Среда может быть так же использована для накопления бактериальной массы широкого круга микроорганизмов. 4 табл.

Жидкая питательная среда для глубинного культивирования бактерий Plesiomonas shigelloides штамм №16, содержащая питательную основу, калий фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, сульфат магния, натрий серноватистокислый, отличающаяся тем, что она содержит в качестве основы питательной среды ферментативный гидролизат казеина с содержанием аминного азота 138 мг% и исходной концентрацией водородных ионов 7,2 ед. рН при следующем содержании компонентов, г/л:

Калий фосфорнокислый двузамещенный 2,2

Калий фосфорнокислый однозамещенный 1,7

Сульфат магния 0,6

Натрий серноватистокислый 0,6

Ферментативный гидролизат казеина

с содержанием аминного азота 138 мг%

и исходной концентрацией водородных

ионов 7,2 ед. pH Остальное