Способ определения протеолитической активности желудочного сока Советский патент 1986 года по МПК G01N33/48 A61B10/00 

I

Изобретение относится к медицине и может быть использовано при исследовании заболеваний желудка.

Целью изобретения является повышение точности способа при опреде-: лении ингибирующей активности.

На чертеже представлен график для определения концентрации пепсина.

Способ осуществляется следующим образом.

Берут желудочный сок, контролируют ферментативную активность пепсина в реакции гидролиза гемоглобина, из анализируемой пробы выделяют ингибитор протеолиза обработкой желудочного сока иммобилизованным, пепсином, освобождают ингибитор из образовавшегося комплекса солю- билизацией, реакцию гидролиза гемоглобина -пепсином проводят в параллельных пробах в. присутствии выделенного ингибитора и без него, а по разности активностей пепсина в данных пробах судят С торможении.

Для проведения операций градуирования, определения концентрации про теолитического фермента и активност ингибитора в качестве эталона ис- .пользуют обычный кристаллический песин, а операцию вьщеления ингибитора осуществляют с применением иммо- билизованного пепсина, на силохро- ме через посредник-поливинилпирро- лидонакролеин (для сохранения натив- ной структуры фермента, что важно для полного проявления его сродства ,к вьщеляемому ингибитору).

Носитель иммобилизованного пепсина (силохром) имеет крупные размеры частиц. Это ускоряет процесс выделения ингибитора.

Для предотвращения ферментативного гидролиза белков и соосаждения сопутствующих продуктов ферментативного распада выделение ингибитора протеолиза осуществляют на холоду при 2-5.

Пример. У шести пациентов с помощьк тонкого зонда осуществляют забор желудочного сока в течение часа. Из каждой полученной порции сока берут по 25 мл выделения ингибитора пепсина, а остальной исполь- зуют в лаборатории дляопределения рН, протеолитической активности и др...

Активность пепсина определяют по скбрости расщепления им кристалли395931

ческого гемоглобина по общепринятому методу Ансоиа. Для зтой цели составляют инкубационную смесь следующего состава: 0,2 мл 0,2 М фосфатный буфер; 0,1 мл 2%-ного раствора гомо- глобина в 0,12 М HCJ,0,1 мл водного раствора кристаллического пепсина в концентрации 5-30 мкг/мл.

В контрольную пробу, против коfQ торой производят измерения опытных образцов, вместо фермента вносят 0,1 мл дистиллированной воды. Смесь инкубируют 20 мин при . Затем в каждую пробирку вносят по 5 мл 5%-ной

15 трихлоруксусной кислоты (ТХУ) , инкубируют 2 мин при 37°С и фильтруют через бумажные фильтры. В полученных фильтратах определяют оптическую плотность на спектрофотометре при длине волны 280 им в 1. см кюветы при комнатной температуре. Значение оптической плотности фильтратов являются показателем активности фермен- . та в описанных условиях проведения

25 реакции протеолиза. Зависимость активности пепсина от его концентрации представлена в табл. 1. .

Т а б л и ц а I

20

Для построения графика зависимости активности пепсина от его концентрации 30 мг кристаллического пепсина марки ХЧ растворяют в дистиллированной воде и объем раствора доводят до 100 мл. Из полученного раствора с точной концентрацией фермента (300 мкг/мл) готовят ряд разведений, как указано в табл. 1, ставят реакцию и определяют оптическую плотность фильтрата. Показатели оптической плотности фильтрата.

3

представленные в табл. I , являются средними величинами из 5 опытов,

На основании полученных результатов стрюят график зависимости активности пепсина от его концентрации (фиг, 1), с помощью которого по протеолитической активности желудочного сока определяют соде1ржание в нем пепсина.

Для определения содержания .пепсина в пробах желудочного сока составляют реакционную, сме сь как при определении активности пепсина, но вместо 0,1 мл фермента, вносят в нее 0,1 мл желудочного сока и проводят реакцию гидролиза гемоглобина как при определении активности пепсина. По полученным величинам оптической плотности фильтратов с помощью графика зависимости активности пепсина от его концентрации (фиг,1) определяют концентрацию фермента в анализируемых пробах. Полученные в работе значения содержания пепсина в желудочном соке шести пациентов представлены в табл. 2.

Далее выделяют ингибитор протео- литических ферментов из желудочного сока. В 6 пробирок, содержащих по 25 мл охлажденного в ледяной бан е до 2+5 С желудочного сока пациентов, прибавляют по 25 мл суспензии пепсина, иммобилизованного на сило- хроме через посредник - поливинил- пирролидонакролеин, и инкубируют в течение часа, периодически перемешивая. Дальнейшая работа также ведется на холоду - в ледяной бане при и предварительно охлажденной центрифуге до той же температуры. Образовавшийся комплекс пепсин - ингибитор осаждают центрифугированием в течение 10 мин. Осадок промывают от неспецифически сорбировавшихся компонентов 0,1 М трис - НС1 буфером рН 7,0 и вновь осаждают центрифугированием в тех же условиях. Для диссоциации полученного комплекса солюбилизации выделяемого пепсина его обрабатывают 25 мл трис-НС1 . буфера рН 7,0, содержащего 1,0 М хлористый натрий в течение 30 мин (для полноты диссоциации) и разделяют центрифугированием в указанном ранее режиме. Полученные таким образом су- пернатанты содержат ингибитор проте- олитических ферментов, выделенный из желудочного сока пациентов.

395934

Определение активности ингибитора проводят пятикратно для каждого пациента. Для этого в 36 пробирок (6 пациентов по 5 проб - 30. проби5 рок, 5 пробирок для определения активности пепсина без ингибитора, и 1 пробирка - контроль, против которой измеряют остальные пробы вносят инкубационную смесь, В 30 пробирок

10 добавляют по 0,1 мл ингибитора, выделенного из желудочного сока пациентов, а в 5 пробирок по 0,1 мл буфера, использовавшегося для солюбилизации ингибиторов (в этих пробах оп15 ределяют активность кристаллического пепсина, а в предыдущих 30 пробирках - влияние на эту реакцию .ингибитора) . Все пробы .инкубируют 20 мин при ЗУС, обрабатывают ТХУ,

20 фильтруют, определяют оптическую плотность раствора и по графику {фиг. 1) находят концентрацию пепсина в анализируемых пробах.

Активность ингибитора определяют

25 по разнице активностей фермента в пробах без ингибитора и в пробах с внесенным ингибитором.

Протеолитическая активность желудочного сока и активность ингибито30 ра пепсина, выделенного из :;елудоч- ного сока тех же пациентов представлена в табл. 2, т - о .Таблица 2

35.

Г-в

Г-в

Т-о

К-о

И-в П-в .

0,320+0,01219А,5+25,3

0,286+0,,4+18,2

0,307+0,022154,2+9,8

0,221+0,016113,9+11,4

0,296+0,025. 148,0+25,3

0,270+0,034138,7+14,8

При клинических исследованиях Желудочного сока пациентов о содержании в нем пепсина судят по протеолитической активности желудочного сока. Однако истинное содержание пепсина может бытьскрыто наличием в исследуемой смеси ингибиторов протеолитической активности, содержание которых также должно зависеть от физиологического состояния пациента и влияния различных факторов.

В способе .вьделяют вещества, обладающие сродством к пепсину, что присуще, главным образом, ингибиторам данной реакции.

Способ учитывает влияние ингибиторов протеолиза и повыщает тем самым надежность процедуры обследования больных.

&

о р м у л а

изобретения

Способ определения протеолитичес- кой активности желудочного сока путем взаимодействия его с гемоглобиЮ 15 20 гЗ 30

Пепсин MKz/мл.

Составитель М.Позняк Редактор В.Иванова Техред Н.Бонкапо

Заказ 3389/43 Тираж 778 . Подписное ВНИИПИ Государственного комитета СССР

по делам изобретений и открытий 113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д, 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

ном с последующей фотометрией продуктов гидролиза, отличающийся тем, что, с целью повыщения точности способа при определении ингибирующей активности, желудочный сок дополнительно инкубируют с.пепсином, иммобилизованным на си- лохроме, промывают 0,1 М трис-буферным раствором(Элюируют силохром 1 М раствором NaCi, далее цовторно определяют протеолитическую актив ность желудочного сока с помощью гемоглобина в присутствии получениоI o элюата и по снижению активности в сравнении с исходной определяют ингибирующую активность желудочного сока.

Корректор -Е.Рошко ,

Изобретение относится к медицине. Цель изобретения - повышение точности способа, В желудочном соке контролируют ферментативную активность пепсина в реакции гидролиза гемоглобина, Желудочньй сок инкубируют с пепсином, иммобилизованным на силохроме. Промывают О,1 М трио- буфером. Элюируют силохром I М раст-. вором NaCl. Повторно определяют протеолитическую активность желудочного сока с помощью гемоглобина в присутствии полученного элюата. По снижению активности в сравнении с исходной определяют ингибирующую активность желудочного сока. 1 ил, 2 табл. ю со ф СП со 00