Способ хранения фрагментов талломов анфельции с карпоспорами Советский патент 1991 года по МПК A01G33/00 

Изобретение относится к марикультуре водорослей - макрофитов, а именно к методам хранения и посадки их посевного материала, в частности спороносных зон талломов, и может быть использовано в лабораторном и промышленном выращивании этих водорослей, а также в селекции новых их форм с целью получения сверхпродуцентов и резкого увеличения съема продукции с плантаций и в промышленных цехах.

Морские водоросли - макрофиты таксо- номически относятся к нескольким разным типам низших растений и отличаются сложным длительным онтогенезом с неоднократным чередованием полового и бесполого размножения и сменой гаметофитного и

спорофитного поколений. Цикл развития занимает несколько лет, а пик выхода капрос- пор в условиях естественных зарослей продолжается у анфельции не более двух недель, причем не одновременно у разных растений, и карпоспоры в первые же часы прикрепляются к песку дна, иначе они погибают. Все это затрудняет марикультуру и в особенности лабораторно-промышленное выращивание этих растений и селекционно- генетическую работу с ними. Между тем потребность в такой работе большая, так как природные запасы наиболее ценных для человека видов уже истощены. Это полностью относится и к Anfeltia plicata, принадлежащей к типу красных водорослей

СЬ

2

О 00

4

(Rhodophyta) и являющейся единственным источником агар-агара - студнеобразующе- го вещества - важного и дефицитного сырья для медицинской, пищевой и кондитерской промышленности.

Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных карпоспор.

Способ осуществляют следующим образом.

Собирают спороносящие растения ан- фельции, выделяют фрагменты талломов с карпоспорами, помещают их в контейнер, добавляют раствор криопротектора - диме- тилсульфоксид (ДМСО) в концентрации |11,7% с сахарозой в концентрации 10- 20%, охлаждают контейнеры со скоростью 0,4-0,5°С/мин. После достижения температуры замерзания раствора инициируют образование кристаллов льда с последующей стабилизацией температуры среды, окружающей контейнеры, на период времени, необходимый для выравнивая температуры внутри и снаружи контейнера. После этого контейнеры помещают в жидкий азот и хранят необходимое время. После этого проводят оттаивание контейнеров и последующее разбавление криопротектора.

По завершении этих операций фрагменты талломов готовы к высаживанию и проращиванию.

Пример. Отбирают женские растения со спорангиями - нематециями в период массового созревания и выхода карпоспор. Талломы растений затем содержат в естественной, постоянно аэрируемой морской воде при 4-8°С и освещении 1500-2000 л к белым светом люминесцентных ламп. Вырезают фрагменты талломов диаметром 0,8-1,2 мм и длиной 2-3 см с нематециями. В состав криопротектора - диметилсуль- фоксида вводят сахарозу в количестве 15± 5%. В опытах используют пастеризованную (стерилизация 35 мин при 68 ±1°С) естественную морскую воду. Фрагменты вместе с раствором криопротектора переносят в полиэтиленовые контейнеры емкостью 1 мм, которые помещают в ледяную баню. Вкладывают контейнеры в плоские стальные тонкостенные перфорированные кассеты и помещают в камеру программного замораживателя.

Программа замораживания включает: первоначальное охлаждение со скоростью 0,4-0,5°С/мин до точки замерзания раствора, которая рассчитывается заранее в зависимости от его концентрации. Затем проводят инициацию кристаллизации путем очень быстрого (0,5 ± 0,2 с) погружения кассеты с контейнерами в жидкий азот и

возвращения ее тотчас же обратно в камеру замораживателя, температуру в которой стабилизируют в течение 10-20 мин. Этот период времени необходим для выравнивания температуры в контейнерах, где в момент инициации ,«. происходит пик кристаллизации, с температурой в камере замораживателч. Далее контейнеры помещают в жидкий азот. Хранение при столь

низких температурах (-196°С) может быть практически неограниченно длительным, так как биохимические процессы и перестройка кристаллов льда полностью исключены.

Оттаивание контейнеров проводят путем встряхивания в воде при 40°С до почти полного исчезновения последнего кристаллика льда, затем их быстро помещают в ледяную баню и переносят в холодильную

камеру, где их содержимое постепенно разбавляют в 10-30 раз и фрагменты талломов высаживают в чашки Петри. Выходящие из нематециев фрагментов карпоспоры, пережившие экстремальную процедуру глубокого замораживания, прикрепляются непосредственно к дну чашек, где и прорастают. Через 7-10 дней удаляют фрагменты талломов и полностью меняют воду в чашках. В дальнейшем смену воды производят

каждые 10 дней или помещают чашки в культиватор с проточной аэрированной морской водой. Выжившие споры формируют типичные проростковые трубки и диски тетраспо- рофитов (табл.1 и 2).

Табл.1 показывает, что процент проросших спор, формирующих нормальные диски, увеличивается в результате снижения скорости замораживания на первом этапе процесса и благодаря введению в состав

криопротектора сахарозы.

Из табл.1 и 2 видно, что наилучший и высокий (92% проросших карпоспор) результат был получен при скорости замораживания на первом этапе 0,4-0,5°С/мин и

при концентрации сахарозы 15%.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет хранить и высаживать фрагменты талломов анфельции с достаточно высокой эффективностью формирования

карпоспорами растений-тетраспорофи- тов. Использование изобретения обеспечит хозяйственников и исследователей посевным материалом анфельции в любое удобное для них время и в необходимых

количествах.

Формула изобретения Способ хранения фрагментов талломов анфельции с карпоспорами, предусматривающий сбор спороносящих растений, выделение фрагментов талломов с карпоспорами, помещение их в контейнеры, добавление в контейнеры раствора криопротектора, в качестве которого используют диметилсуль- фоксид, охлаждение контейнеров, помещение их в жидкий азот, оттаивание и последующее разбавление криопротектора, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода жизнеспособных кар- поспор, раствор криопротектора содержит

сахарозу в концентрации от 10 до 20%, охлаждение проводят со скоростью 0,4-0,5°С/мин, при этом во время охлаждения после достижения температуры замерзания раствора осуществляют инициацию образования кристаллов льда в растворе с последующей стабилизацией температуры среды, окружающей контейнеры, на период времени, необходимый для выравнивания температуры внутри и снаружи контейнера.

Таблица 1

Изобретение относится к марикультуре водорослей-макрофитов, а именно к методам хранения и посадки их посевного мате2 риала, и может быть использовано при лабораторном и промышленном выращивании водорослей. Целью изобретения является повышение выхода жизнеспособных карпоспор. Выделенные фрагменты талломов с карпоспорами помещают в контейнеры, добавляют диметилсульфоксид с концентрацией сахарозы от 10 до 20%, охлаждают контейнеры со скоростью 0,4-0,5°С/мин. По достижении температуры замерзания раствора осуществляют инициацию образования кристаллов льда, после чею стабилизируют температуру среды, окружающей контейнеры, на время, необходимое для выравнивания температуры внутри и снаружи контейнера Затем контейнеры помещают в жидкий азот и хранят необходимое время, После этого проводят оттаивание контейнера и разбавление криопротектора. 2 табл. w fe

Число карпоспор (%), прорастающих вполне нормально после глубокого замораживания, хранения и оттаивания, в зависимости от скорости охлаждения.

Условия прототипа как по скорости, так и по добавлению ДМСО.

Число карпоспор (%), прорастающих вполне нормально после глубокого замораживания со скоростью 0,4 - 0,5°С/мин на первом этапе, в зависимости от концентрации сахарозы в

растворе криопротекторов.

Таблица 2