Способ определения активности антитромбина Ш в плазме крови Советский патент 1990 года по МПК G01N33/68 

И

и ка новн- НИН :

обретение относится к медицине :ается определения активности ос- зго ингибитора системы свертьша- срови антитромбина III.

изобретения - ускорение споЦ|У1Ь

соба

Hi представлены кривые

инактивации тромбина конт- и опытного образцов по оси значения Ig t,,, а на оси . соответственно время ьшания фибриногена в пробах и

инкубации проб (на фиг.2 верх- ривая - по предлагаемому, ниж- по известным способам).

достигается- тем, что опреде- активности антитромбина III ствляют в реакционной среде с

параметрами для проявле- аксимальной ингибитор ной активскорости

рольного

ординат

абсцисс

свер :

времг:

няя I

няя

Цель лени( осущ

оптш ильными ния

ности антитромбина III исследуемой плазмы крови. Для этого исходные компоненты реакционной смеси - тромбин и исследуемую плазму разводят до стандартных концентраций 0,15 М раствора NaCl, с рН 8,0-8,2. При ионной силе раствора ,1 и 0,2, активности антитромбина III 44 и 21% соответственно.

При использовании данной реакционной среды создаются условия для увеличения на 25-30 скорости реакции тромбин/антитромбин III исследуемой плазмы, что приводит к уменьшению времени определения активности антитромбина. III на 25-30% по сравнению с известным способом.

Способ-осуществляют следующим об-- раэом.

О О 00 01

00

ел

Для осуществления способа используют следующие реагенты;

реакционная среда; 1 об,ч. О,1 М натрийфосфатного буфера с рН 8,0-8,2 (готовят смешиванием 95,0 мл 0,2 М раствора и 5,0 мл 0,2 М раствора , проверяют и корректируют рН в пределах 8,0-8,2 на иономет- ре, затем доводят дистиллированной водой до 200,0 мл) и 1 об,ч. 0,15 М раствора NaCl;,0, раствор NaClj тромбин 20 ед. NiH/мл в растворе реакционной среды.

Предварительно заготовленный раст- вор тромбина активностью 100 ед, NiH/мл хранят в силиконированных флаконах при температуре -20°С, перед употреблением разводят в 5 раз реакционной средой до требуемой активно- сти; фибриноген 8-10 г/л раствор в 0,15 М NaCl (достаточно до 5 мл) готовят перед исследованием; плазма крови (опытная и контрольная). Получают по обычной методике бестромбоци- тарную плазму из венозной крови, стабилизированной 38 г/л тринатрий- цитратом в соотношении 9:1. Контрольная плазма, это пул плазм от 8-10 доноров. Сохраняется небольшими о.бъ- емами (до 1,0 мл) во флаконах при температуре -20°С в течение 1 года без потери активности антитромбина III,

Перед употреблением контрольную и опытную плазмы разводят реакционной средой в 10 раз (к 0,45 мл реакционной среды добавляют 0,05 мл плазмы), получая 10%-ные растворы контрольной и опытной плазм. Для каждой исследуе мой плазмы готовят по 4 стеклянные пробирки с 0,1 мл раствора фибриногена и помещают в водяную баню при температуре 37°С,

Приготовленные пробирки с реаген- тами и раствор тромбина перед иссле- дованйем прогревают до этой температуры.

Манипуляции, проводимые с контрольным и опытным образцами плазмы, являются идентичными: в пробирку с . 0,5 МП исследуемой плазмы добавляют 0,5 МП раствора тромбина. Смесь встряхивают для получения малообъемного сгустка фибрина, Фибриновьй сгусток отжимают и сразу удаляют из реакционной смеси. На 4,6,8 и 10 мин инкубации (Ццц) берут по 0,1 мл смес и добавляют в пробирки с О,1 мл раствора фибриногена. Секундомером регистрируют время свертывания (t) фибриногена остаточным тромбином смеси.

Отбор проб смеси можно делать и при других значениях tj,, увеличить или уменьшить кратность забора. Однако забор проб не должен быть больше 10 мин. инкубации смеси, так как резко возрастает значение t, а затем нарушается линейность хода реакции после 14-15 мин инкубации.

Вычисление, Из полученных в секундах значений t на 4,6,8 и 10 мин инкубации смеси, извлекают десятичньй логарифм и получают соответствующие значения Ig t, Кривые скорости инактивации тромбина антитромбином III контрольного и опытного образцов плазмы строят на миллиметровой бумаге в координатах: значения Ig t на оси ординат, оси абсцисс. Обычно построенные кривые не имеют общего значения Ig t, при нулевом значении t,. При расчете необходимо совместить начальные точки кривых с соблюдением угла их наклона (фиг,1 считают, что любая выбранная точка на кривой скорости инактивации тромбина антнтромбином III контрольного образца соответствует 100% активности антитромбина III (такая точка взята на 10 мин инкубации смеси) К ней соотносят точки вновь полученных кривых для опытных образцов (при одинаковом значении tj) и таким образом получают искомое значение активности антитромбина III опытных образцов,

Пределы нормальных колебаний активности антитромбина III, определенные для донорской группы (19 человек), составляют 84-116%, 100 2,0 (Xi m). Коэффициент вариации для данного метода не превышает 1%

Пример 1. У пациента 1, исследуя активность антитромбина III плазмы крови предлагаемым способом в динамике (tnf,4,6,8 и 10 мин), получили значения ,5i 71j 112 и 182 с и соответственные значения lgtp U658« 1,85Г, 2,049 и 2,260, Для построения калибровочной кривой исследовали контрольную плазму при тех же значениях Сияц, получили, что ,5; 63; 96,5i 148 с и соответственные значения ,618i 1,799i 2,170,

По полученным значениям Igt ст|роят (фиг.1) кривые для контроль- нсго образца плазмы (к) и для исследуемого образца плазмы пациента 1 (Ij). При соотношении точек на 10 ми инкубации для кривых опытного (П) контрольного (к) образцов плазмы

и

на тр 11

пр tia ли и

ро

ан

ЦП

ни зн

НС

йдено, что значение активности ант омбина III у пациента 1 равно 0%, - зто в пределах нормы.

Пример 2, При исследовании обы плазмы крови у пациента 2 в ди мике (t|,4; 6; 8 и 10 мин) получизначения ,5, 39,8; 56,5, 79

соответственно им значения lgt ,460, 1,600, 1,752 и 1,898. Пост- енная по полученным значениям Igt кр|ивая скорости инактивации тромбина титромбином III образца плазмы па- ента 2 (П) не имеет общего значе- с калибровочной при нулевом

Igtfe

ачении t. Для получения возмож- сти их сравнения моделируют новую

кривую (на фиг.1 обозначена крупным ппрйхом).для пациента 2. Путем соотношения точек, взятых на 10 мин инку

ба

ции на калибровочной

1608585

смоделированной кривой (nj), найдено значение активности антитромбина III для пациента 2, равное 79%, что ниже нормы.

На фиг.2 верхняя кривая относится к предлагаемому, нижняя - к известному способам. 100% активность (точка в) по известному способу достигнута только через 4,5 мин, по отношению к предлагаемому способу (точка А).

Формула изобретения

Способ определения активности антитромбина III в плазме крови путем смешивания исследуемой и контрольной плазм с раствором тромбина с последующей регистрацией скорости инактивации тромбина в пробах в динамике и их сравнения, отличающ ий- с я тем, что, с целью ускорения способа, регистрацию проводят в среде инкубации, содержащей 0,1 М натрий- фосфатный буфер с рН 8,0-8,2 и Q,15 М раствор хлористого натрия в объемном соотношении 1:1.

S9

19

eputi

100 т Anffiuay)OMSuHM( f4

50%

.Z

100% АТ Ж(%) 150%

Изобретение относится к медицине, а именно к способам определения активности антитромбина Ш в плазме крови. Цель - ускорение способа. Измеряют скорости инактивации стандартного количества тромбина антитромбином Ш исследуемой плазмы, строят кривые скорости инактивации тромбина антитромбином Ш опытного и контрольного образцов плазмы, посредством сравнения которых получают искомое значение активности антитромбина Ш исследуемого образца. Исследование проводят в реакционной среде, содержащей 0,1 М натрий-фосфатного буфера и 0,15 М раствора NACL в объемном соотношении 1:1, PH 8,0-8,2. 2 ил.