Способ подготовки посевного материала продуцента тилозина SтRертомYсеS FRaDIae Советский патент 1990 года по МПК C12P19/62 C12P19/62 C12R1/54 

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения тилозина - антибиотика, используемого в ветеринарии „

Целью изобретения является снижение потери активности.

Установлено, что исходный высокоактивный клон при требующихся в соответствии с известным способом пересевах на плотные среды прогрессивно теряет биологическую.активность.

Продуктивность клонов культуры Streptomyces fradiae 165 при размножении на скошенной агаризованной среде приведена в табл.1.

Таблица 1

ел

Продуктивность, ед/мл , при генерации

TEIllLU

IV

ЬЭ

сл оо

Эталонную культуру S. fradiae 165 пересевают на плотной среде, содержащей, мас.%: соевая мука 0,5; меласса свеклосахарная 0,5, кукурузный экстракт 0,5; крахмал 0,5; аммоний серно-кислый 0,1; натрий хлористый 0,1; магний серно-кислый 0,05; кальций углекислый 0,2; агар 1,5; вода остальное Проводят 4 последовательных пассажа. Продуктивность клонов каждого пассажа проверяется на жид- кой питательной среде в стандартных условиях (длительность культивирования 9 суток) состав среды, масД: мука рыбная 2,0, меласса свеклосахарная 2,0; крахмал 1,5; диаммонийфос- фат 0,02; натрий хлористый 0,2; маг- ний серно-кислый 0,2; кальций углекислый 0,5, масло соевое 3,0, вода остальное. Объем колб 350 мл, количество среды 30 мл.

Способ осуществляют следующим образом.

Эталонную культуру S. fradiae высевают на плотную среду и отбирают колонии, характеризующиеся типичными морфологическими признаками. Посев осуществляют так, чтобы на одной чашке Петри вырастало не более 50 колоний. Отобранные колонии по отдельности высевают на жидкую среду и выращивают в течение 8-12 суток для определения продуктивности каждого клона после завершения процесса культивирования. В процессе культивирования из. каждой пробы отбирают на 2-3 сутки культивирования по 5-10 мл суспензии вегетативной культуры и храня в холодильнике до окончания процесса ферментации. После определения прдуктивности каждого клона выявляют наиболее продуктивный клон и 2-3-су- точную культуру этого клона, хранящуюся в холодильнике, используют для наработки посевного материала. 2-3-с точную культуру наиболее продуктивного клона высевают в жидкую питательную среду. Обычно посев проводят в колбы объемом 750 мл, заполненные 100 мл питательной среды. Полученный 2-3-суточный биологический материал используют в качестве посевного материала для засева колб большего объема и в большем числе. Могут быть использованы, например, колбы объемом 3000 мл, заполненные 400 мл питательной среды. Культивирование проводят в то же время, т,е„ 2-3-сутокв

г 0 5 0

5

0

35

40

Процесс размножения посевного материала повторяют до тех пор, пока не будет наработано необходимое количество посевного материала, которое зависит от применяемого ферментационного оборудования. При этом кратность пересевов и разовые объемы фермента- Ьионной среды могут быть изменены, но в любом случае требуется,-чтобы размножение посевного материала проводилось только в жидкой питательной среде.

Кроме того, в соответствии с предлагаемым способом размножение культуры осуществляют пересевом 2-3-суточ- ной культуры, в то время как известный способ предусматривает пересевы 8-12-суточной культуры.

Преимущества предлагаемого способа состоят в том, что значительно сокращается время наработки посевного материала, необходимого для засева промышленного аппарата. Например, для засева промышленного аппарата объемом 63 м3, требуется 3-4 м посевного материала. Для наработки такого его количества обычно требуется не менее 10 косяков посевной культуры, полученных с эталонного образца. Как правило,для наращивания 10 косяков осуществляют первоначальный засев эталонной культурой 4-5 косяков, а затем на втором этапе с первичных косяков проводят засев еще 6-8 косяков. Общая продолжительность процесса размножения только первичного материала составляет таким образом 16-. 24 суток, а всего для приготовления требуемого количества посевного материала затрачивается суток. Для наработки этого же количества посевного материала по предлагаемому способу необходимо лишь 25-29 суток исходя из расчета, приведенного в

табл.2.

Таблица 2

Выращивание эталонной культуры на плотной среде Выращивание отдельных клонов на плотной среде

8-12 8-12

8-12

Продолжение табл.2

Проверка продуктивности клонов 10 10 Размножение клонов на косяках (первый этап) 8-12 Размножение клонов на косяках (второй

этап)8-12

Выборочная проверка продуктивности10 - Наработка посевного материала

в колбах3 3

Наработка посевного материала

в инокуляторс 2 2 Наработка посевного материала в посевном аппарате2 2 Всего 59-75 25-29

Описан вариант реализации предлагаемого способа, начинающийся с эталонной культуры. Однако в процессе промышленного производства возможно сокращение времени, необходимого для получения требуемого количества посевного материала. Так, например, выросшая из отобранного клона первичная суспензия (2-3-суточная суспензия вегетативного материала) имеет объем порядка 5-10 мл и может быть использована для засева 10-20 колб с объемом питательной среды 100 мл каждая. Часть полученного материала может использоваться для дальнейшего наращивания количества посевного материала, а часть может быть сохранена для использования в следующем промышленном процессе.

Кроме того, первичный посевной- материал, выращенный на основе отобранного наиболее продуктивного клона может быть размножен и при этом необ ходимость использования эталонного материала может быть сокращена. Иным0

5

0

5

словами.от

единичного эталонного об разца может быть по предлагаемому способу получено больше качественно- го посевного материала, чем из единичного эталонного образца при использовании известного способа.

Крайне важным обстоятельством при этом является то, что размножаемый с эталонного образца посевной материал, получаемый известным способом, теряет активность, а полученный по предлагаемому способу ее не теряет. Потеря продуктивности посевного материала, получаемого известным способом, показана в табл,1.

Стабильность продуцирующей активности биоматериала, получаемого предлагаемым способом, показана в табл.3,

ТаблицаЗ

Образование тилозина, ед/мл, при ко- личестве пересевов

3400

4000

3800

Культура S. fradiae 165 выращивается на среде состава, мас.%: рыбная мука 2,0; меласса свеклосахарная 2,0; крахмал 1,5, диаммонийфосфат 0,02; натрий хлористый 0,2; магний серно-кислый 0,2; кальций углекислый 0,5; масло соевое 3,0; вода остальноеI

В качестве исходной взята культура, выделенная из единичного клона с соответствующей продуктивностью. Продуктивность определяется на 9 сутки культивирования. В качестве посевной дозы на каждый последующий посев расходуется не более 10% культуры предыдущего пассажа. Выращивание осуществляют в колбах объемом 750 мл, содержащих 100 мл среды. Только исходная культура выращена в колбе объемом 300 мл с 30 мл среды.

Установлено, что при хранении первичной культуры, выращенной иэ единичного, эталонного клона, ее продуктивность практически не снижается при сроке хранения до 90 суток (время наблюде ний) при температуре от 0 до +2°С, что показано в табл.4.

Таблица

Выращивание во всех случаях проводится на среде, содержащей, мас.%: мука рыбная 2,0; меласса свеклосахарная 2,0; крахмал 1,5; диаммоний- фосфат 0,02; натрий хлористый 0,2; магний серно-кислый 0,2; кальций углекислый 0,5, масло соевое 3,0; вода остальное.

Пример 1. Эталонную споровую суспензию культуры S. fradiae 165 высевают в чашки Петри на плотную среду, содержащую, мас.%: соевая мука 0,5; меласса свеклосахарная 0,5;

кукурузный экстракт 0,5; крахмал 0,5; жидкости составляет 4900 ед/мл. аммоний серно-кислыи 0,1; натрий

15 ются на качалке при 28°С в тече 2 суток. В результате получено ПОСЕВНОГО материала.

Полученным посевным материал количестве 100 мл засевают лабо ный ферментер объемом 1,7 л, за ный 1,1 л среды, содержащей, ма мука рыбная 2,0, меласса свекл ная 2,0; крахмал 1,5; диаммоний фосфат 0,02; натрий хлористый 0 магний серно-кислый-0,2; кальци лекислый 0,5; масло соевое 3,0; остальное. Выращивание в станда

20

25

условиях при 28°С продолжается Концентрация тилозина в культур

В качестве посевного материа пользуют первичный биоматериал, ращенный из единичного эталонно разца, размноженный до объема в 100 мл в один этап. Посевная до составляет 10%. Продуктивность деляется на 9 сутки ферментации

35

хлористый 0,1; магний серно-кислый 0,05; кальций углекислый 0,2; агар 1,5; вода остальное. Засеянные чашки помещают в термостат и выдерживают при 28° С в течение 10 сут.

Для дальнейшего анализа отбирают 9 выросших колоний с типичными морфологическими признаками. Каждую из этих колоний переносят в отдельную д« колбу объемом 350 мл, заполненную 30 мл среды состава, мас.%: мука рыбная 2,0; меласса свеклосахарная 2,0; крахмал 1,5; диаммонийфосфат 0,02; натрий хлористый 0,2; магний сернокислый 0,2; кальций углекислый 0,5, масло соевое 3,0, вода остальное. Колбы помещают на качалку и культивирование осуществляют при 28 С.

Через 70 ч культивирования из каждой колбы стерильно отбирают по 5 мл суспензии, которую помещают в холодильник с температурой 2°С. Засеянные колбы культивируют на качалке в течение еще 6 суток. После завершения

45

50

В качестве посевного материала и пользуют первичный биоматериал, выращенный из единичного эталонного о разца, размноженный до объема в 100 мл в один этап. Посевная доза составляет 10%. Продуктивность опре деляется на 9 сутки ферментации.

Таким образом, уровень антибиоти образования в лабораторном процессе находится на уровне продуктивности эталонной культуры.

П р и м е р 2. Эталонную споровую суспензию культуры S. fradiae B-45 используют для приготовления посев ного материала в условиях примера В качестве исходного используют наиболее продуктивный клон № 13, выд ленный на плотной среде, продуктивность которого составляет 2900 ед/м

В лабораторном ферментере объем 1,7 л накопление тилозина составляет 3100 ед/мл.

Таким образом,, использование пр

культивирования (т.е. через 9 суток) лагаемого способа по- сравнению с в культуральной жидкости методом диф- известным позволяет сохранить про- фузии в агар определяют достигнутую дуктивность посевного материала на

концентрация тилоэина 4500 ед/мл достигнута в колбе № 5.

Из холодильника изымают 70-часовую

пробу культуральной жидкости из колбы № 5, которую в дальнейшем используют в качестве посевного материала. Этой суспензией в количестве 0,5% засевают 10 колб объемом 750 мл, заполненных 100 мл среды состава,.мас.%: соевая мука 2,5; глюкоза 2,5; кукурузный экстракт 1,0; хлористый натрий 0,2; углекислый кальций 0,5, вода остальноео Засеянные колбы выдержива5 ются на качалке при 28°С в течение 2 суток. В результате получено 1000мл ПОСЕВНОГО материала.

Полученным посевным материалом в количестве 100 мл засевают лабораторный ферментер объемом 1,7 л, заполненный 1,1 л среды, содержащей, мас.%: мука рыбная 2,0, меласса свеклосахарная 2,0; крахмал 1,5; диаммоний- фосфат 0,02; натрий хлористый 0,2; магний серно-кислый-0,2; кальций углекислый 0,5; масло соевое 3,0; вода остальное. Выращивание в стандартных

0

5

жидкости составляет 4900 ед/мл.

условиях при 28°С продолжается 211 ч. Концентрация тилозина в культуральной

жидкости составляет 4900 ед/мл.

5

« 45

50

В качестве посевного материала используют первичный биоматериал, выращенный из единичного эталонного образца, размноженный до объема в 100 мл в один этап. Посевная доза составляет 10%. Продуктивность определяется на 9 сутки ферментации.

Таким образом, уровень антибиотико- образования в лабораторном процессе находится на уровне продуктивности эталонной культуры.

П р и м е р 2. Эталонную споровую суспензию культуры S. fradiae B-45 используют для приготовления посевного материала в условиях примера 1. В качестве исходного используют наиболее продуктивный клон № 13, выделенный на плотной среде, продуктивность которого составляет 2900 ед/мл,

В лабораторном ферментере объемом 1,7 л накопление тилозина составляет 3100 ед/мл.

Таким образом,, использование предлагаемого способа по- сравнению с известным позволяет сохранить про- дуктивность посевного материала на

Изобретение относится к биотехнологии и касается получения тилозина - антибиотика, используемого в ветеринарии. Цель изобретения - снижение потери активности. С этой целью в способе приготовления посевного материала продуцента тилозина путем высева эталонной культуры на плотную среду, отбора типичных колоний, проверки продуктивности выделенных клонов и размножения высокопродуктивных клонов пассирование с отобранными на плотной среде клонами проводят на жидкой питательной среде. 4 табл.

концентрацию тилозина. Наибольшая

уровне активности эталонной культу91541258 10

ры и при этом значительно сократить ces fradiae путем посева исходной время, необходимое для приготовления культуры на плотную среду с последу- посевного материала.ющим пассированием на питательных

средах, отличающийся Формула изобретениятем, что, с целью снижения потери

активности, с плотной среды отбираСпособ подготовки посевного мате- ют клон и пассирование его проводят риала продуцента тилозина Streptomy- на жидких питательных средах.