СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРЕПАРАТА ДЛЯ БОРЬБЫ С БОЛЕЗНЯМИ РАСТЕНИЙ Российский патент 2000 года по МПК A01N63/04 

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к производству препарата для борьбы с бактериальными и грибковыми болезнями растений.

Одним из микробиологических препаратов, применяемых для борьбы с болезнями растений, является фитобактериомицин, который в качестве действующего начала содержит комплекс стрептотрициновых антибиотиков с преобладанием в нем стрептотрицинов С и D (Мельникова Е.А., Макарова Г.Я., Кругляк Е. Б. Антибактериальная активность и токсичность антибиотика фитобактериомицина и входящих в него стрептотрицинов // Физиологически активные вещества.- Киев, 1980.- N 12, стр. 93-96).

Известен способ получения препарата фитолавин, содержащего в своем составе фитобактериомицин, Фитолавин применяют для борьбы с бактериальными и грибковыми заболеваниями растений: корневыми гнилями злаковых, бактериозами овощных культур и др. (Гаврилина Г.В., Лободюк В.Д., Периханова А.Г., Попков Г. П. , Софиенко И.А., Шепетуха И.М., Эстеркес Е.В. Результаты изучения фитолавина // Сб. научных трудов. Препараты микробиологического синтеза - сельскому хозяйству.- М" 1981, стр. 25-30).

Для получения фитолавина используют культуру Streptomyces lavendulae штамм 12-10 ВНИИбакпрепарат. Выращивание культуры ведут глубинным способом на жидкой питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли; после окончания ферментации культуральную жидкость концентрируют в вакууме, высушивают на распылительной сушилке и получают продукт, содержащий 100000 ед. антибиотика в г.

Антибиотический комплекс содержит стрептотрицина С - 17-27%; стрептотрицина D-45-55%.

Недостатком такого способа получения фитолавина является низкое содержание антибиотика в готовом продукте и невысокий его выход на конечной стадии производства.

В последнее время для производства фитолавина предлагается использовать другой вид микроорганизма, а именно Streptomyces griseus, в частности штамм S. griseus-420, в связи с его высокой продуктивностью, обеспечивающей больший выход с единицы производственного объема.

При использовании культуры S. griseus штамм 420 получают препарат фитолавин-300, содержащий 300000 ед./г. Антибиотический комплекс препарата содержит стрептотрицина С - 22% и стрептотрицина D - 54%. Производственные испытания фитолавина-300 показали его высокую эффективность в борьбе с болезнями растений (Быкова Г. А., Белых Е.Б., Строева И.А., Новикова И.И. Активность фитолавина, полученного на основе двух штаммов продуцентов // Защита растений от вредителей и болезней в условиях экологизации сельскохозяйственного производства. - С-Пб., 1992, стр. 66-70).

Однако на практике оказалось, что не каждый клон S. griseus-420 способен продуцировать стрептотрициновый комплекс, идентичный фитобактериомицину, т. е. продуцировать в основном стрептотрицины С и D. В ряде случаев появлялись клоны, синтезирующие в основном стрептотрицин F, обладающий низкой антибактериальной и антигрибковой активностью.

Предлагаемое изобретение представляет собой способ получения препарата для борьбы с болезнями растений - фитолавина-300 с необходимым компонентным составом стрептотрицинового комплекса и высоким выходом целевого продукта.

Такой результат достигается путем отбора на стадии подготовки посевного материала штамма Streptomyces griseus-420 клонов, образующих в основном стрептотрицины С и D, а также путем оптимизации условий ферментации отобранных клонов, способствующих образованию стрептотрицинового комплекса необходимого состава, что достигается с помощью внесения в ферментационную среду лизина в количестве 0,01-0,2%.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:
В культуру S. griseus 420 на скошенном агаре добавляют дистиллированную воду и производят смыв спорового материала с косяка. Полученную после фильтрования через стеклянный фильтр N4 чистую суспензию единичных спор высевают на чашки Петри с глюкозо- картофельной агаризованной средой и растирают ее по чашке. После культивирования при 28±1^oC в течение 12 дней проводят пересев 100 колоний с чашек Петри на скошенный глюкозо-картофельный агар и выращивают при 28±1^oC в течение 10 дней, после чего культуру проверяют на продуктивность. Для этого из каждой скошенной культуры берут по кусочку агаровой среды со спорами и вносят в качалочные колбы, емкостью 750 мл, со средой следующего состава (%): мука кукурузная - 4,0; KH₂PO₄ - 0,03; (NH₄)SO₄ - 0,06; NH₄NO₃ - 0,7; NaCI - 0,2; MgSO₄ - 0,05, CaCO₃ - 0,5; вода водопроводная -до 100 (приведены усредненные значения концентраций, которые для каждого отдельного компонента могут изменяться в интервале ±15%). Значение pH до стерилизации - 6,6-7,2. Выращивание ведут на качалке с числом оборотов 220 в мин и выращивают инокулят при температуре 28±1^oC в течение 24-30 час. Затем инокулят из каждой колбы в количестве 5% переносят в колбы с ферментационной средой следующего состава (%): кукурузная мука - 3-5; меласса - 1,5-2,0; лизин - 0,01-0,2; (NH₄)₂SO₄ или NH₄NO₃ - 0,6-0,7; KH₂PO₄ - 0,01-0,09; NaCI -0,05- 0,25; MgSO₄ - 0,005-0,05; CaCO₃ - 0,5-1,5; пропинол - 0,1-0,5; вода водопроводная. Выращивание ведут на качалке при температуре 28±1^oC в течение 72 часов. Определение уровня антибиотикообразования и компонентный состав антибиотического комплекса проводят следующим образом: пробы культуральной жидкости из каждой колбы в количестве 20-25 мл подкисляют разбавленной соляной кислотой до pH 4,5 и, после выдерживания в течение 30 мин фильтруют через бумажный фильтр. В фильтратах определяют содержание антибиотика микробиологическим методом с использованием в качестве тест-культуры Вас. subtilis 6633 (ГФ XI, вып.2).

Компонентный состав антибиотической фракции определяют с помощью тонкослойной хроматографии на пластинках с силикагелем 60. В качестве подвижной фазы используют раствор следующего состава: ацетат натрия - 123,03 г, хлорид натрия -58,44 г, спирт бутиловый третичный - 100 мл, вода дистиллированная - до 1000 мл.

Хроматографию проводят восходящим способом. По окончании хроматографирования пластинку высушивают на воздухе. Далее хроматограмму равномерно опрыскивают 0,2% раствором нингидрина в ацетоне. Пластинку прогревают в сушильном шкафу при 105^oC в течение 5 мин. Компоненты стрептотрицинового комплекса проявляются в виде фиолетовых пятен на розовом фоне. Хроматографирование испытуемых образцов нативного раствора ведут в сравнении со стандартным образцом чистого фитобактериомицина, содержащим (в %):
стрептотрицин В - 2,0
стрептотрицин С - 20,0
стрептотрицин D - 50,0
стрептотрицин E - 13,0
стрептотрицин F - 15,0
По результатам хроматографирования отбирают клоны, образующие антибиотический комплекс, соответствующий стандартному образцу фитобактериомицина и используют их для наработки посевного материала на скошенном агаре. Из 100 проверенных клонов только 15% образуют антибиотический комплекс необходимого состава.

Продуктивность отобранных клонов по антибиотикообразованию составляют 20000-36000 ед./мл.

Приготовленный посевной материал используют для производства препарата. Для чего вначале на качалке выращивают посевной материал в маточных колбах на среде следующего состава, %:
мука кукурузная - 4,0
KH₂PO₄ - 0,03
(NH₄)₂SO₄ - 0,06
NH₄NO₃ - 0,7
NaCI - 0,2
MgSO₄ - 0,05
CaCO₃ - 0,5
вода (водопроводная) - до 100
pH - 6,6-7,2
Через 24-36 часов роста при температуре 28±1^oC на качалке с 200-220 об/мин получают стандартный вегетативный посевной материал.

Этим посевным материалом в количестве 5% засевают посевные аппараты на предварительно простерилизованную питательную среду. Время выращивания - 24-36 часов. Затем полученный посевной материал передают в промышленные ферментаторы в количестве 5-10% на предварительно простерилизованную ферментационную среду следующего состава, %: кукурузная мука - 3-5; меласса -1,5-2,0; лизин -0,01- 0,2; (NH₄)₂SO₄ или NH₄NO₃ - 0,6 - 0,7; KH₂PO₄ - 0,01 - 0,09; NaCI - 0, 05 - 0,25, MgSO₄ - 0,005 - 0,05; CaCO₃ -0,5-1,5; пропинол -0,1- 0,5. Процесс биосинтеза антибиотика идет 60±10 часов, при температуре 28±1^oC, расходе воздуха 1,0-1,5 м³/м³• мин, при этом образуется 20000-33000 ед. /мл антибиотика. Процесс биосинтеза может осуществляться в безмешалочных ферментаторах.

Далее культуральную жидкость подкисляют до pH 5,0-5,5, упаривают на вакуум-выпарной установке до 10-12% сухих веществ, сушат на распылительной сушилке при температуре на входе 140-160^oC, на выходе - 60-70^oC. Стандартизуют мелом или каолином до получения препарата, содержащего 300000 ед./г, готовый препарат упаковывают в крафт-мешки по 10, 15, 20 кг. При этом потери антибиотика составляют 18±2 %.

Сведения, подтверждающие возможность осуществления изобретения
Пример 1. Приготовленный вышеописанным способом посевной материал штамма Str. griseus-420 из пробирок на скошенном агаре пересеяли в маточные колбы со стерильным пеногасителем и питательной средой следующего состава, %:
мука кукурузная - 4,0
KH₂PO₄ - 0,03
(NH₄)₂SO₄ - 0,6
NH₄NO₃ - 0,7
NaCI - 0,2
MgSO₄ - 0,05
CaCO₃ - 0,5
вода водопроводная - до 100
pH - 6,8-7,2
Через 24 часа роста при температуре 28±1^oC на качалке с 200-220 об/мин получили стандартный посевной материал.

Этим посевным материалом в количестве 5% засеяли посевные аппараты на вышеописанную предварительно простерилизованную питательную среду. Время выращивания - 24 часа. Затем полученным посевным материалом засеяли промышленные ферментаторы в количестве 5% на предварительно простерилизованную ферментационную среду следующего состава: кукурузная мука - 3%, меласса - 1,5; лизин - 0,01; NH₄NO₃ - 0,7; NaCI - 0,2; MgSO₄ - 0,05; CaCO₃ - 0,5; пропинол - 0,1. Время ферментации - 50 часов при температуре 28±1^oC, расходе воздуха 1,0-1,5 м³/м³•мин. Активность культуральной жидкости составила 30000 ед/мл. Содержание стрептотрицина С составило 22%, стрептотрицина D - 52%. Далее культуральную жидкость подкислили соляной кислотой до pH 5,0-5,5, упарили на вакуум-выпарной установке до 10% сухих веществ, сушили на распылительной установке при температуре воздуха на входе 150^oC, на выходе - 65^oC. Стандартизовали мелом, готовый препарат упаковывали в крафт-мешки по 20 кг. Потери по антибиотику составили 18±2%.

Пример 2. Подготовку посевного материала и технологию биосинтеза провели как в примере 1. Время выращивания посевного материала составило 36 часов. 10% посевного материала засеяли ферментационную среду следующего состава, %: кукурузная мука -5,0; меласса - 2,0; лизин - 0,1; KH₂PO₄ - 0,03; NaCI - 0,2; MgSO₄ - 0,05; CaCO₃ - 0,5; пропинол -0,1 и вода. Время ферментации 70 часов при температуре 28±1^oC. Активность культуральной жидкости 33000 ед/мл. Компонентный состав антибиотической фракции соответствовал стандартному образцу фитобактериомицина.

Далее культуральную жидкость подкислили до pH 5,5, упарили на вакуум-выпарной установке до 12% сухих веществ, сушили на распылительной сушилке при температуре воздуха 160^oC на входе и 70^oC на выходе. Стандартизовали каолином, готовый препарат упаковали в крафт-мешки по 20 кг. Потери по антибиотику составили 20%.

Пример 3. Подготовку посевного материала и биосинтез провели, как описано в примере 1. Время выращивания посевного материала составило 30 часов. 5% посевного материала засеяли ферментационную среду следующего состава, %: кукурузная мука - 4,0, меласса - 1,8, лизин - 0,05, KH₂PO₄ - 0,03, NaCI - 0,2, MgSO₄ - 0,05, CaCO₃ - 0,5, пропинол - 0,1. Время ферментации - 60 часов при температуре 28±1^oC. Активность культуральной жидкости 32000 ед./мл. По компонентному составу антибиотик соответствовал фитобактериомицину.

Далее культуральную жидкость подкислили до pH 5,5, упарили на вакуум-выпарной установке до 10% сухих веществ, сушили на распылительной сушилке при температуре на входе 140^oC, на выходе - 60^oC. Стандартизовали каолином, готовый препарат упаковывали в крафт-мешки по 20 кг. Потери по антибиотику составили 18%.

При использовании более обедненных ферментационных питательных сред (чем описано в примере 1) активность культуральной жидкости значительно снижается. При использовании более обогащенных ферментационных сред (чем описано в примере 2) получаются густые среды и активность культуральной жидкости также значительно снижается.

Как видно из приведенных примеров, с помощью данного способа получения фитовлавина можно за 60±10 часов ферментации достичь активности культуральной жидкости 30000- 33000 ед. /мл или 10000 - 11000 мкг/мл и достичь выхода антибиотика 8-9 кг/м³ культуральной жидкости.

Изобретение относится к микробиологическому производству препарата для борьбы с бактериальными и грибковыми болезнями растений. Способ получения препарата для борьбы с болезнями растений, содержащего в качестве действующего начала комплекс стрептотрициновых антибиотиков, включает подготовку посевного материала, выращивание продуцента - Streptomyces griseus штамм 420 на ферментационной среде, содержащей источники азота, углерода, минеральные соли и 0,01 -0,2% лизина, последующее концентрирование и высушивание культуральной жидкости и стандартизацию препарата. При подготовке посевного материала отбирают клоны с преимущественным образованием стрептотрицинов С и D c помощью тонкослойной хроматографии. Целесообразно для выращивания продуцента использовать среду следующего состава (%): мука кукурузная 3-5, меласса 1,5-2,0, лизин 0,01-0,2, (NH₄)₂SO₄ или NH₄NO₃ 0,6-0,7, КН₂РО₄ 0,01-0,09, NaCl 0,05-0,25, MgSO₄ 0,005-0,05, СаСО₃ 0,5-1,5, пропинол 0,1-0,5, вода - остальное. Способ позволяет достичь выхода антибиотика 8-9 кг/м³ культуральной жидкости. 2 з.п. ф-лы.

1. Способ получения препарата для борьбы с болезнями растений, содержащего в качестве действующего начала комплекс стрептотрициновых антибиотиков, включающий подготовку посевного материала, выращивание продуцента на ферментационной среде, содержащей источники азота, углерода и минеральные соли, концентрирование и высушивание культуральной жидкости и стандартизацию препарата, отличающийся тем, что в качестве продуцента используют Streptomyces griseus штамм 420, при подготовке посевного материала ведут отбор клонов с преимущественным образованием стрептотрицинов С и D, а выращивание продуцента ведут на ферментационной среде, содержащей 0,01 - 0,2% лизина. 2. Способ по п.1, отличающийся тем, что выращивание продуцента ведут на ферментационной среде следующего состава, %:
Мука кукурузная - 3 - 5
Меласса - 1,5 - 2,0
Лизин - 0,01 - 0,2
(NН₄)₂SO₄ или NН₄NО₃ - 0,6 - 0,7
КН₂РО₄ - 0,01 - 0,09
NаCl - 0,05 - 0,25
MgSO₄ - 0,005 - 0,05
СаСО₃ - 0,5 - 1,5
Пропинол - 0,1 - 0,5
Вода - Остальное
3. Способ по п.1, отличающийся тем, что отбор клонов при подготовке посевного материала ведут с помощью тонкослойной хроматографии.