ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ КУЛЬТИВИРОВАНИЯ БАКТЕРИЙ BACILLUS SUBTILIS BN-135- ПРОДУЦЕНТА ПЕКТАТ-ЛИАЗЫ Российский патент 2015 года по МПК C12N1/20 C12N9/88 

Изобретение относится к микробиологической промышленности и касается питательной среды для культивирования бактерии Bacillus subtilis BN-135 - продуцента пектат-лиазы.

Препарат на основе пектат-лиазы может быть использован при получении ферментсодержащих лекарственных средств, применяемых для лечения и профилактики заболеваний, связанных с нарушениями процессов пищеварения, а также при получении препаратов, применяемых с целью увеличения выхода и улучшения качества овощных и фруктовых соков и пюре, плодово-ягодного осветленного вина, эфирных и растительных масел, чая, при обработке трудноусвояемых растительных кормов и получении биологических добавок для сельского хозяйства.

Фермент пектат-лиаза относится к ферментам мацерирующего действия и осуществляет негидролитическое расщепление трансэлиминативным путем пектиновых веществ, в том числе нерастворимого пектина - протопектина растительной ткани, составляющего основу межклеточных веществ и «цементирующего» растительную ткань. При этом растительная ткань распадается на отдельные клетки, образуя гомогенную массу с сохранением пищевых волокон. При расщеплении протопектина увеличивается уровень растворимого пектина и образуются олигогалактурониды, которые, так же, как и растворимый пектин, являются эффективными энтеросорбентами и выводят из организма соли тяжелых металлов и токсины.

Составы питательных сред для культивирования продуцентов пектат-лиазы хорошо изучены на лабораторном и полупромышленном уровнях. В их составе в качестве источника углерода чаще всего используются источники пектина, в частности свекловичный жом или его гидролизат, иногда - крахмалсодержащее сырье.

Известна питательная среда для глубинного культивирования продуцента мацерирующих ферментов Bacillus circulans 31 (А.с. СССР 1026405. Питательная среда для глубинного культивирования Bacillus circulans 31 - продуцента мацерирующих ферментов, 1981), содержащая, г/л: щелочной гидролизат свекловичного жома - 26-80, кукурузный экстракт 4-20, мочевину - 3-10, кальций углекислый - 0,5-5,0, калий сернокислый - 0,5-3,0. Продуцент культивируют в аэробных условиях в течение 18 часов в слабощелочной зоне при начальном значении pH питательной среды 8,2-8,5. Предлагаемая питательная среда позволяет получить активность пектат-транс-элиминазы (по новой классификации ферментов - пектат-лиазы) до 60 ед/мл за 18 часов роста.

Существенным недостатком указанной питательной среды является низкая активность пектат-транс-элиминазы (пектат-лиазы) в культуральной жидкости.

Известна питательная среда для культивирования факультативно-анаэробной бактерии Bacillus polymyxa в способе получения фермента, разрушающего растительный материал - пектат-транс-элиминазы (пектат-лиазы) (Патент ФРГ №137585. Фермент, разрушающий растительный материал, процесс его получения и использования в составах для пищеварения, 1974), который предусматривает культивирование штамма в аэробных условиях при использовании питательной среды, содержащей в качестве источника углерода крахмал, сахарный тростник, мелассу, глюкозу или смесь этих компонентов, а в качестве источника азота - муку соевых бобов, кукурузный экстракт, дрожжевой экстракт, пептон, нитраты, соли аммония или смесь двух и более этих компонентов совместно с органическими и/или неорганическими солями, особенно с углекислым кальцием. Предложено проводить культивирования продуцента периодическим способом при постоянном перемешивании и аэрации и поддержании pH на уровне 5,2-7,8 в течение от 2 до 4 суток. При выделении фермента из культуральной жидкости получен выход пектат-транс-элиминазы (пектат-лиазы) до 30000 ед/мл.

К недостаткам указанной питательной среды можно отнести при достаточно высокой активности пектат-транс-элиминазы (пектат-лиазы) длительный период культивирования продуцента.

Наиболее близким аналогом прототипом к заявляемой питательной среде является питательная среда для культивирования аэробной бактерии Bacillus subtilis ЦМПМ В-2691 - продуцента пектолитических ферментов (А.с СССР №1160742. Штамм Bacillus subtilis ЦМПМ В-2691 - продуцент пектолитических ферментов, 1985). Питательная среда для культивирования содержит, г/л: свекловичный жом молотый - 40,0, аммоний фосфорнокислый двузамещенный - 75,0, калий фосфорнокислый однозамещенный - 10,0, кукурузный экстракт - 5,0, мел - 5,0, вода водопроводная - остальное. Оптимальные условия культивирования: pH среды 8,1-8,3; температура 37-42°C. Максимальное содержание пектат-транс-элиминазы (пектат-лиазы) на данной питательной среде достигается к 18-20 часу культивирования и составляет 7500 ед/мл. Дополнительно штамм синтезирует эндополигалактуроназу с активностью 20 ед/мл и экзополигалактуроназу с активностью 2,0 ед/мл.

Недостатком данной питательной среды является низкая активность пектат-трансэлиминазы (пектат-лиазы) в культуральной жидкости.

Для крупномасштабного производства ферментов решающим кроме наличия сверхпродуктивных штаммов-продуцентов является состав питательной среды, который, прежде всего, влияет на уровень выхода целевого продукта и, соответственно, на рентабельность всего процесса.

Питательные среды на основе свекловичного жома достаточно обеднены углеводами. Основную массу жома составляют пектиновые вещества, содержание которых может достигать до 40%, и клетчатка (до 22%). Свекловичный жом как отход производства сахарозы из сахарной свеклы не имеет стандартного состава, поэтому каждую партию жома необходимо характеризовать по химическому составу и проверять в лаборатории при опытном культивировании. Свекловичный жом требует предварительного измельчения и жестких режимов стерилизации, что увеличивает энергозатраты при производстве фермента. Культуральная жидкость, полученная с использованием свекловичного жома, плохо фильтруется. Кроме того, в настоящее время образующиеся объемы свекловичного жома не могут в полной мере обеспечить потребности сельского хозяйства для кормления с/х животных и микробиологической промышленности для получения ферментных препаратов (Грачева, И.М., Кривова А.Ю. Технология ферментных препаратов / 3-е изд., перераб. и доп. - М.: «Элевар», 2000. - 512 с.).

Техническая задача, на решение которой направлено настоящее изобретение, состоит в разработке нового более продуктивного и технологичного состава питательной среды, содержащего доступное и дешевое сырье и обеспечивающего высокий синтез пектат-лиазы.

Технический результат, который может быть получен при осуществлении изобретения, состоит в повышении активности пектат-лиазы в культуральной жидкости до значений не ниже 40000 ед/мл за 18-22 часа культивирования.

Для достижения указанного технического результата для глубинного культивирования Bacillus subtilis BN-135 - продуцента пектат-лиазы предложено использовать питательную среду, состоящую из источника углерода, кукурузного экстракта, аммония фосфорнокислого двузамещенного, калия фосфорнокислого однозамещенного, питательных солей и водопроводной воды. С целью повышения активности пектат-лиазы в культуральной жидкости в качестве источника углерода предложено использовать вместо свекловичного жома крахмалсодержащий субстрат - муку ржаную или ячменную, предварительно гидролизованную грибной целлюлазой, в качестве питательных солей - кальций хлористый и натрий углекислый при следующем соотношении компонентов, вес. %:

мука ржаная гидролизованная или   мука ячменная гидролизованная 2,5-4,0 кукурузный экстракт 0,4-0,6 аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,6-1,0 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,3-0,5 кальций хлористый 0,05-0,15 натрий углекислый 0,15-0,2 вода водопроводная остальное

Ржаная и ячменная мука, используемые в составе питательной среды, содержат в своем составе кроме крахмала также клетчатку, гемицеллюлозу и пентозаны. Количественное содержание углеводов в данном виде крахмалсодержащего сырья представлено в таблице 1.

В качестве ферментного препарата предложено использовать целлюлолитические ферментные препараты грибного происхождения, например Целловиридин или ЦеллоЛюкс-F, содержащие в своем составе кроме целлюлазы также ферменты глюканазу и ксиланазу. Ферментный состав указанных препаратов представлен в таблице 2.

Гидролиз крахмалсодержащего субстрата предложено проводить грибной целлюлазой из расчета 5 ед. целлюлазы на 1 г сырья в течение 1,0-2,0 ч при температуре 50°C.

Использование муки ржаной или ячменной, предварительно гидролизованной грибным целлюлолитическим ферментным препаратом, позволяет получить питательную среду, содержащую редуцирующие сахара в количестве, не вызывающих репрессию синтеза пектат-лиазы. Наличие в среде легкометаболизируемых сахаров в оптимальных концентрациях в виде продуктов деградации углеводов муки способствует сокращению начальной непродуктивной стадии культивирования (лаг-фазы), более быстрому росту продуцента и накоплению повышенного количества биомассы, что приводит к значительному повышению уровня биосинтеза фермента в культуральной жидкости.

Заявляемая питательная среда имеет значение pH близкое к нейтральному (около 7,0), которое является оптимальным для биосинтеза пектат-лиазы бактерией Bacillus subtilis BN-135. Выращивание продуцента на данной среде ведется при естественном значении pH питательной среды, что исключает дополнительные операции по корректировки pH среды перед засевом и в процессе культивировании продуцента.

В предлагаемом изобретении активность пектат-лиазы определяли по способности расщеплять свекловичный пектин низкой степени этерификации (степень этерификации 35-37%). За единицу активности принято такое количество фермента, которое за 1 час при 40°C и pH 8,4 вызывает образование ненасыщенных продуктов деградации пектина, увеличивающих оптическую плотность на 0,1. Метод основан на прямом спектрофотометрическом определении ненасыщенных продуктов распада пектина, имеющих максимальную оптическую плотность при длине волны 235 нм, в кварцевых кюветах с толщиной поглощающего слоя 10 мм.

Возможность использования изобретения иллюстрируется примерами, которые не ограничивают объем и сущность притязаний, связанных с ним.

Пример 1

Культуру Bacillus subtilis BN-135 выращивали в качалочных колбах вместимостью 750 мл, содержащих 50 мл питательной среды следующего состава, вес. %:

мука ржаная гидролизованная 2,5 кукурузный экстракт 0,6 аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,6 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,3 кальций хлористый 0,1 натрий углекислый 0,15 вода водопроводная остальное

Ржаную муку предварительно гидролизовали ферментным препаратом Целловиридин из расчета 5 ед. целлюлазы на 1 г сырья в течение 1,0 ч при температуре 50°C. Питательную среду стерилизовали при давлении 0,1 МПа в течение 45 мин.

В качестве посевного материала использовали водную суспензию спор культуры продуцента, которые образуются на поверхности скошенного картофельного агара после инокулирования и выращивания в течение 48 ч при 40°C. Для получения посевного материала в пробирку со скошенным агаром вносили 20 мл стерильной водопроводной воды и делали смыв с косяка с помощью микробиологической петли в асептических условиях. Споровый посевной материал вносили в количестве 5% к объему ферментационной среды. Культивирование проводили в аэробных условиях на качалке с частотой вращения 200-220 об/мин при естественном значении pH питательной среды и температуре 40°C. Активность пектат-лиазы в культуральной жидкости через 20 ч культивирования продуцента составила 41600 ед/мл.

Пример 2

Культивирование бактерии Bacillus subtilis BN-135 проводили в течение 22 часов в условиях, соответствующих условиям примера 1, на питательной среде следующего состава, вес. %:

мука ячменная гидролизованная 3,0 кукурузный экстракт 0,4 аммоний фосфорнокислый двузамещенный 1,0 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,5 кальций хлористый 0,05 натрий углекислый 0,15 вода водопроводная остальное

Гидролиз ячменной муки проводили ферментным препаратом Целловиридин из расчета 5 ед. целлюлазы на 1 г сырья в течение 2,0 ч при температуре 50°C. Активность пектат-лиазы в культуральной жидкости через 22 часа культивирования продуцента составила 42300 ед/мл.

Пример 3

Культивирование Bacillus subtilis BN-135 проводили в ферментере «BIOSTAT» объемом 10 л (коэффициент заполнения 0,5) на питательной среде следующего состава, вес. %:

мука ржаная гидролизованная 4,0 кукурузный экстракт 0,5 аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,8 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,4 кальций хлористый 0,15 натрий углекислый 0,2 вода водопроводная остальное.

Гидролиз ржаной муки проводили ферментным препаратом ЦеллоЛюкс-F из расчета 5 ед. целлюлазы на 1 г сырья в течение 1,5 ч при температуре 50°C. Питательную среду стерилизовали при давлении 0,1 МПа в течение 45 мин.

Для засева питательной среды использовали водную суспензию спорового посевного материала культуры Bacillus subtilis BN-135 в количестве 5% к объему питательной среды.

Выращивание культуры в ферментере проводили при следующих условиях: температура 40°C, непрерывная аэрация (подача воздуха - 1 об. на 1 об. среды в мин) и перемешивание со скоростью вращения мешалки 200 об/мин при естественном значении pH.

Продолжительность ферментации - 18 часов.

Активность пектат-лиазы в культуральной жидкости через 18 часов культивирования продуцента составила 48400 ед/мл.

Таким образом, предлагаемая питательная среда для культивирования бактерии Bacillus subtilis BN-135 - продуцента пектат-лиазы содержит доступное и дешевое сырье, а ее использование позволяет повысить активность пектат-лиазы в культуральной жидкости по сравнению с прототипом в 5,5-6,5 раз (с 7500 ед./мл до 41600-48400 ед./мл) за 18-22 часа культивирования.

Изобретение относится к биотехнологии. Питательная среда для глубинного культивирования бактерий Bacillus subtilis BN-135 содержит муку ржаную гидролизованную или муку ячменную гидролизованную, кукурузный экстракт, аммоний фосфорнокислый двузамещенный, калий фосфорнокислый однозамещенный, кальций хлористый, натрий углекислый и водопроводную воду при заданном соотношении компонентов. Изобретение позволяет повысить активность пектат-лиазы. 2 табл. 3 пр.

Питательная среда для глубинного культивирования бактерий Bacillus subtilis BN-135 - продуцента пектат-лиазы, состоящая из источника углерода, кукурузного экстракта, аммония фосфорнокислого двузамещенного, калия фосфорнокислого однозамещенного, питательных солей и водопроводной воды, отличающаяся тем, что питательная среда в качестве источника углерода содержит крахмалсодержащий субстрат - муку ржаную или ячменную, предварительно гидролизованную грибной целлюлазой, в качестве питательных солей - кальций хлористый и натрий углекислый при следующем соотношении компонентов, вес.%:
мука ржаная гидролизованная или   мука ячменная гидролизованная 2,5-4,0 кукурузный экстракт 0,4-0,6 аммоний фосфорнокислый двузамещенный 0,6-1,0 калий фосфорнокислый однозамещенный 0,3-0,5 кальций хлористый 0,05-0,15 натрий углекислый 0,15-0,2 вода водопроводная остальное