ШТАММ STREPTOMYCES FRADIAE - ПРОДУЦЕНТ ТИЛОЗИНА Российский патент 1996 года по МПК C12P1/06 C12P1/06 C12R1/54 

Изобретение относится к области промышленного получения антибиотиков, синтезируемых микроорганизмами, а именно к производству антибиотика тилозина.

Предлагаемый штамм Streptomyces fradiae ВНИИСХМ-53 продуцент тилозина получен из популяции штамма Streptomyces fradiae ВНИИА-1899 (1) после обработки суспензии его спор тормозным короткоимпульсным облучением с последующим торможением репаративных процессов и ступенчатым отбором активных вариантов по признаку тилозинобразование (схема получения штамма представлена на чертеже).

Штамм ВНИИСХМ-53 более стабилен и обладает повышенной продукцией тилозина (13-16 г тилозина на 1 л культуральной жидкости), чем исходный штамм ВНИИА-1899 (11 г тилозина на 1 л культуральной жидкости).

Предлагаемый штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) под номером ВНИИСХМ-53.

Штамм Streptomyces fradiae ВНИИСХМ-53 характеризуется следующими культурально-морфологическими и физиологическими признаками.

Микроморфологические признаки. Культура имеет неспиральные спороносцы, расположенные моноподиально.

Макроморфологические и культуральные признаки штамма.

Минеральный агар I (Гаузе-I) (28^оС; рН 7,2-7,4; возраст 21 день). Образует плоские колонии с ровными краями белого цвета. Обратная сторона кремовая. Спороношение умеренное. Пигмент в среде не обнаружен.

Овсяная среда (28^оС; рН 7,2; возраст 21 день). Образует плоские колонии белого цвета с неровными краями. Обратная сторона желтого цвета. Спороношение умеренное. Пигмент не выделяет.

Органическая среда 2 (Гаузе-2) (28^оС; рН 7,0-7,2; возраст 21 день). Образует плоские колонии белого цвета с неровными краями. Обратная сторона желтого цвета. Спороношение умеренное. Пигмент в среде не обнаружен.

Крахмально-аммиачная среда (28^оС; рН 7,0; возраст 21 день). Образует плоские колонии белого цвета с неровными краями. Обратная сторона желтого цвета. Спороношение умеренное. Пигмент в среде не обнаружен.

Пептонно-дрожжевая среда с железом (28^оС; рН 7,0-7,2; возраст 21 день). Образует выпуклые колонии белого цвета. Обратная сторона желто-бурая. Спороношение умеренное. В агар выделяется пигмент светло-бурого цвета.

Глицерин-аспарагиновая среда (28^оС; рН 7,0-7,4; возраст 21 день). Колоний не обнаружено.

Физиолого-биохимические признаки. Аэроб. Оптимальная температура роста 28±1^оС. Оптимальное значение рН равняется 6,5-6,8. Максимальное накопление антибиотика наблюдается через 168-220 ч. Желатину разжижает слабо. Крахмал и казеин гидролизует. Отношение к источникам углерода: усваивает глюкозу, фруктозу, маннит, сахарозу, мальтозу, арабинозу. Рамнозу усваивает слабо.

Антагонистические свойства. Продуцируемый штаммом S.fradiae-ВНИИСХМ-53 антибиотик тилозин подавляет рост грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. Не подавляет рост дрожжей. На грибы действует избирательно.

Предлагаемый штамм иллюстрируется следующим примером.

Споры штамма Streptomycеs fradiae-ВНИИСХМ-53 выращивают в течение 10 сут при 28^оС на агаризованной среде следующего состава, мука соевая 0,5; кукурузный экстракт 1; меласса 1,5; крахмал 1,5; (NH₄)₂SO₄0,15; NaCl 0,1; MgSO₄ 0,05; CaCO₃ 0,3; агар 2.

Кусочек агаризованной среды со спорами вносят в качалочные колбы емкостью 750 мл, содержащие 50 мл посевной среды следующего состава в мука соевая 2,5; глюкоза 2,5; кукурузный экстракт 1; NaCl 0,2; мел 0,5; масло соевое 0,2. Значение рН до стерилизации -7,2. Стерилизуют при 0,8 ати 40 мин.

Колбы устанавливают на качалку с числом оборотов 220 в минуту и выращивают инокулят при температуре 28^оС в течение 72 часов. Затем инокулят в количестве 5% переносят в колбы с ферментационной средой следующего состава в рыбная мука 2; меласса 2; крахмал кукурузный 1,5; NACl 0,2; MgSO₄ 0,2; (NH₄)₂HPO₄ 0,02; мел 0,5; масло соевое 3,0. Стерилизация при 1 ати 1 ч.

Колбы устанавливают на качалку с числом оборотов 220 в 1 минуту и выращивают инокулят при 28^оС в течение 72 ч. Затем инокулят в количестве 5% переносят в колбы с ферментационной средой следующего состава, в рыбная мука 2; меласса 2-4; крахмал картофельный 2,5; СаСО₃ 0,5; MgSO₄0,2; NaCl 0,2; (NH₄)₂HPO₄ 0,04; масло соевое 3,0; вода водопроводная, рН до стерилизации 6,8-7,2, стерилизация при 0,8 ати 40 мин.

Ферментацию проводят в течение 168-220 ч при 28^оС. Количество тилозина в культуральной жидкости определяют спект- рофотометрическим методом после экстракции фильтрата культуральной жидкости хлороформом. Метод основан на способности антибиотика избирательно поглощать УФ-лучи в области спектра от 220 до 320 нм с максимумом поглощения при длине волны 282 нм. К 1 мл отфильтрованной жидкости добавляют 19 мл дистиллированной воды, помещают в делительную воронку, добавляют 20 мл хлороформа и тщательно перемешивают, после чего отделяют нижний слой хлороформа и разводят этиловым спиртом в 10 раз. При длине волны 282 нм измеряют на спектрофотометре оптическую плотность раствора, используя в качестве контроля этанол. Содержание тилозина рассчитывают по формуле:
X , где Х количество тилозина, мкг/мл;
D оптическая плотность исследуемого образца;
К коэффициент, учитывающий распределение тилозина в системе вода:хлороформ, равный 1,1;
Р₁ коэффициент разбавления хлороформового экстракта;
Р₂ коэффициент разбавления культуральной жидкости, равный 20;
0,024 удельная экстинкция раствора тилозина с концентрацией 1 мкг/мл.

Среднее содержание тилозина в культуральной жидкости составляет 14,5 г тилозина на 1 л культуральной жидкости при размахе изменчивости по данному признаку 13,0 г 16,0 г/1 л. Исходный штамм ВНИИА 1899 продуцирует в среднем 11 г тилозина на 1 л культуральной жидкости.

Таким образом, предлагаемый штамм продуцент тилозина Streptomyces fradiae ВНИИСХМ-53 позволяет получать на 25% тилозина больше, чем штамм ВНИИА-1899.

Использование: микробиологическая промышленность, промышленное получение антибиотика тилозина. Сущность изобретения: предлагаемый штамм Streptomuces fradial ВНИИСХМ-53 получен из популяции штамма Streptomuces fradiae ВНИИА 1899 путем обработки спор тормозным короткоимпульсным облучением с последующим торможением репаративных процессов и ступенчатым отбором активных вариантов по признаку тилозинобразования. Предлагаемый штамм депонирован в коллекции микроорганизмов ВНИИ сельскохозяйственной микробиологии (г. Санкт-Петербург) под номером Streptomuces fradiae ВНИИСХМ-53. 1 ил.

Штамм Streptomyces fradiae ВНИИСХМ-53 - продуцент тилозина.