Изобретение относится к способу получения меченных тритием линейных пептидов и гликопептидов, и может найти применение в медико-биологических исследованиях.
Цель изобретения - получение меченных тритием линейных пептидов и гликопептидов с более высокой молярной активностью.
П р и м е р 1. В ампулу для изотопного обмена объемом 7 мл загружают 38 мг гетерогенного катализатора, содержащего 5% палладия на ВаSO4, 1,8 мг (8,8 мкмоль) RhCl3, 1 мл воды и 5 мг (8,8 мкмоль) пептида-аналога лейцинэнкефалина (Tyr-DAla-Gly-Phe-DLeu). Смесь замораживают жидким азотом. Воду удаляют с помощью лиофильной сушки.
Ампулу вакуумируют до давления 10-3 гПа и заполняют 100% -ным газообразным тритием до давления 400 гПа. Ампулу нагревают до 100оС и выдерживают при этой температуре 1,5 ч. По окончании реакции тритий удаляют, катализатор отфильтровывают, промывают метанолом 2х10 мл. Фильтрат упаривают и растворяют в 1 мл метанола.
Продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке "Ultraspher Acryl" 5 μm (4,6х150 мм). Градиентная элюция раствора метанола (за 90% ) в 0,01 М ацетате аммония, рН 3,5. Скорость элюции 1 мл/мин. В качестве детектора используют спектрофотометр хроматографа Altex 332. Фракцию, содержащую меченный тритием пептид, лиофилизируют и разбавляют метанолом до радиоактивной концентрации 1 мКи/мл. По данным хроматографии и жидкостного сцинтилляционного счета определяют химический выход продукта, общую радиоактивность и молярную активность. Получают 1600 мкг меченного тритием пептида с общей радиоактивностью 12,7 мКи и молярной активностью 4500 мКи/ммоль. Химический выход продукта 32% .
При хроматографировании в тонком слое установлены следующие значения Rf для полученного соединения: Rf 0,43, силикагель "Merck", бутанол: уксусная кислота: вода = 3: 1: 1.
Rf 0,33 Silufol UV-254, изобутанол: ацетон: аммиак= 15: 9: 9.
Аминокислотный состав полученного пептида: Tyr (0,98), Ala (1,0), Gly (0,95), Phe (1,1), Leu (0,90).
Анализ включения тритиевой метки проводят двухмерной хроматографией кислых гидролизатов пептида в системе изобутанол: ацетон: аммиак (А) и изопропанол: вода: муравьиная кислота 20: 5: 5 (Б). Обнаружено, что тритиевая метка включается в пептид селективно. В С-концевой аминокислоте D-лейцина содержится 80% радиоактивной метки.
Выделенную аминокислоту анализируют на содержание L-изомера с помощью лигандообменной хроматографии на оптически активной смоле. Введение тритиевой метки не сопровождается рацемизацией и снижением биологической активности.
П р и м е р 2. В ампулу для изотопного обмена объемом 7 мл загружают 10 мг гетерогенного катализатора, содержащего 5% палладия на BaSO4, 0,2 мг RhCl3, 1 мл воды и 2 мг (1,0 мкмоль) пептида Arg-Gly-Asp-Pro-Glu-Val-Leu-Ala-Glu-Lys-Val-Ala-Arg-Trp-Leu. Смесь замораживают жидким азотом. Воду удаляют с помощью лиофильной сушки.
Ампулу вакуумируют до 1х10-3 гПа и заполняют тритием до давления 400 гПа. Ампулу нагревают до 80оС и выдерживают при этой температуре 2 ч.
По окончании реакции тритий удаляют, катализатор отфильтровывают, промывают водой (2х5 мл), фильтрат упаривают и растворяют в 1 мл воды.
Очистку продукта проводят на колонке 400х10 мм, упакованной сорбентом КМ-Sefadex-25.
Элюат: 0,5% -ный ацетат аммония, рН 5,2. Скорость элюирования 30 мл/ч. В качестве детектора используют проточный фотометр "Uvicord S". Фракцию, содержащую меченный тритием пептид, лиофилизируют и разбавляют 20% -ным водным этанолом до радиоактивной концентрации 1 мКи/мл. Получают 160 мг меченного тритием пептида с общей радиоактивностью 370 мкКи и молярной активностью 2300 мКи/ммоль.
При хроматографировании в тонком слое установлены следующие значения Rf для полученного соединения: Rf 0,1, Silufol UV-254, изобутанол: ацетон: аммиак= 15: 9: 9, Rf 0,07 силикагель "Merck", бутанол: уксусная кислота: вода = 3: 1: 1.
Аминокислотный состав полученного пептида: Arg (0,95), Gly (1,0), Asp (0,98), Pro (1,0), Glu (0,95), Val (0,95), Ala (0,90), Lys (0,90).
По результатам двухмерной хроматографии продуктов кислотного гидролиза определяют место включения трития: 85% радиоактивности содержится в лейцине.
П р и м е р 3. В ампулу для изотопного обмена объемом 7 мл загружают 23 мл гетерогенного катализатора, содержащего 5% палладий на сульфате бария, 1,2 мг RhCl3, 1 мл воды и 3,8 мг (5,6 мкмоль) гликопептида Glc NAc-Mur NAc-Ala-DGlu.
Смесь замораживают жидким азотом. Воду удаляют с помощью лиофильной сушки.
Ампулу вакуумируют до давления 1х10-3 гПа и заполняют водородом, содержащим 0,1% трития, до давления 400 гПа. Ампулу нагревают до 50оС и выдерживают при этой температуре 3 ч. По окончании реакции тритий удаляют, катализатор отфильтровывают и промывают водой 2х5 мл. Фильтрат упаривают и растворяют в 1 мл воды. Продукт чистят хроматографией в тонком слое на пластинках Силуфол. Раствор наносят в виде узкой полосы и хроматографируют в смеси растворителей бутанол: уксусная кислота: вода = 3: 1: 1. Rf 0,3. Продукт элюируют из зоны водой, упаривают и растворяют в 20% -ном водном этаноле до радиоактивной концентрации 2 мКи/мл.
Получают 1140 мкг меченного тритием гликопептида с общей радиоактивностью 5,5 мкКи и молярной активностью 3300 мКи/моль. Химический выход 30% .
При хроматографировании в тонком слое установлены следующие значения Rf для полученного соединения: Rf 0,25, Silufol UV-254, изобутанол: ацетон: аммиак = 15: 9: 9. Rf 0,22 бутанол: уксусная кислота: вода = 2: 1: 1. Rf 0,58 на F-целлюлозе.
Аминокислотный состав полученного пептида: Ala (1,0), Glu (0,95).
По результатам двухмерной хроматографии продуктов кислотного гидролиза определено место включения трития: 80% радиоактивности в Glu и 20% в Ala.
П р и м е р 4. В ампулу для изотопного обмена объемом 7 мл загружают 30 мг гетерогенного катализатора, содержащего 6% палладия на сульфате бария, 1,6 мг RhCl3, 1 мл воды и 5,5 мг (7,6 мкмоль) гликопептида: Glc-Tur-NAc-Ala-iGlu. Смесь замораживают жидким азотом. Воду удаляют с помощью лиофильной сушки.
Ампулу вакуумируют до давления 1х10-3 гПа и заполняют газообразным тритием до давления 400 гПа, затем нагревают до 70оС и выдерживают при этой температуре 2 ч. Удаление лабильного трития и выделение продукта проводят, как описано в примере 3.
Получают 2100 мкг меченного тритием гликопептида с общей радиоактивностью 11,2 мКи и молярной активностью 4000 мКи/ммоль. Химический выход 35% .
При хроматографировании в тонком слое установлены следующие значения Rf для полученного гликопептида на SilufolI e UV-254 Rf 0,22, бутанол: уксусная кислота: вода = 3: 1: 1, Rf 0,38, изобутанол: ацетон: аммиак= 15: 9: 9; Rf 0,31 бутанол: уксусная кислота: вода = 2: 1: 1.
Аминокислотный состав: Ala (0,98), iGlu (0,95).
По результатам двухмерной хроматографии продуктов кислотного гидролиза определено место включения трития: до 90% радиоактивности содержится в iGlu, 10% в Ala.
П р и м е р 5. В ампулу объемом 7 см3 помещают 10 мг ( ≈ 14 мкмоль) пептида Thr-Lys-Pro-Arg-Pro-Gly-Pro, 200 мг палладиевого катализатора, содержащего 5% Pd/BaSO4, 3 мг (14 мкмоль) RhCl3 в 10 мл воды. Ампулу замораживают жидким азотом и воду удаляют лиофильной сушкой.
Ампулу вакуумируют до давления 1˙ 10-3 гПа и заполняют газообразным тритием до давления 400 гПа. Реакцию изотопного обмена проводят при 80оС 2 ч. По окончании реакции тритий удаляют, катализатор отфильтровывают, и промывают водой 3х5 мл. Фильтрат упаривают и остаток растворяют в 1 мл воды.
Очистку меченного пептида проводят, как описано в примере 1. Фракцию, содержащую пептид, разбавляют 50% -ным водным этанолом до радиоактивной концентрации 5 мКи/мл. Получают 3,2 мг меченного тритием пептида с молярной активностью 100 мКи/ммоль.
П р и м е р 6. В ампулу объемом 7 см3 помещают 15 мг палладиевого катализатора, содержащего 6% Pd/BaSO4 0,36 мг (1,7 мкмоль) RuCl3 и 2 мг (1,7 мкмоль) пептида Met-Glu-His-Phe в 0,3 мл воды. Ампулу замораживают жидким азотом и воду удаляют лиофильной сушкой.
Ампулу вакуумируют до давления 1 10-3 гПа и заполняют газообразным тритием до давления 400 гПа. Реакцию гетерогенного изотопного обмена проводят в течение 3 ч при 100оС. По окончании реакции тритий удаляют, катализатор отфильтровывают и промывают водой (3х5 мл). Фильтрат упаривают и растворяют в 1 мл воды.
Очистку продукта проводят на колонке 400х10 мм, упакованной сорбентом КМ-Sephadex-25. Элюцию осуществляют водой, скорость элюирования 30 мл/ч. В качестве детектора используют проточный фотометр "Uvicord". Фракцию, содержащую меченный пептид, лиофилизируют и разбавляют 20% -ным водным этанолом до радиоактивной концентрации 1 мКи/мл. Получают 210 мкг меченного тритием пептида с общей радиоактивностью 170 мкКи и молярной активностью 1000 мКи/ммоль.
Анализ включения тритиевой метки проводят двумерной тонкослойной хроматографией кислых гидролизатов пептида в системе изобутанол: ацетон: аммиак= 15: 9: 9 (А) и изопропанол: вода: муравьиная кислота = 20: 5: 1 (Б). В С-концевой аминокислоте LPhe содержится 80% радиоактивной метки. Определение оптической чистоты выделенной аминокислоты осуществляют, как описано в примере 1.
П р и м е р 7 (сравнительный). В ампулу объемом 7 см3 помещают 15 мг ( ≈ 40 мкмоль) гликопептида Glc NAc-Mur-NAc-Ala-iGlu, 170 мг гетерогенного катализатора, содержащего 5% палладия на сульфате бария и 1 мл фосфатного буфера рН 8,6. Реакционную смесь замораживают с помощью жидкого азота.
Ампулу вакуумируют до давления 1х10-3 гПа и заполняют 100% -ным газообразным тритием до давления 400 гПа. После размораживания раствора реакцию ведут при 25оС в течение 5 ч при непрерывном перемешивании на магнитной мешалке. По окончании реакции тритий удаляют, катализатор отфильтровывают и промывают водой 2х5 мл. Фильтрат упаривают и растворяют в 1 мл воды. Очистку гликопептида проводят с помощью ионообменной хроматографии на Дауэкс 50 в Н+-форме. Элюция водой, скорость потока 30 мл/ч. Фракции. содержащие пептид, объединяют и упаривают, остаток растворяют в 50% -ном водном этаноле с радиоактивной концентрацией 5 мКи/мл. Получают 13 мг меченного тритием гликопептида с молярной активностью 213 мКи/ммоль. Химический выход 87% .
П р и м е р 8. В ампулу для изотопного обмена объемом 7 мл загружают 15 мг гетерогенного катализатора, содержащего 5% палладия на BaSO4, 0,73 мг (3,5 мкмоль) PhCl3, 0,3 мл диметилацетамида и 2 мг (3,5 мкмоль) пептида аналога лейцина - энкефалина Tyr-DAla-Gly-Phe-Dleu). Ампулу с раствором замораживают жидким азотом, вакуумируют до давления 1 ˙10-3 гПа и заполняют газообразным тритием до давления 400 гПа. Реакцию гетерогенного изотопного обмена проводят 3 ч при комнатной температуре с перемешиванием содержимого ампулы магнитной мешалкой. По окончании реакции тритий удаляют, катализатор отфильтровывают, промывают метанолом (2х3 мл). Фильтрат упаривают и растворяют в 1 мл метанола. Продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке Ultraspher-Acryl 5 μm (4,6х150 мм). Градиентная элюция раствора метанола (30-90% ) в 0,01 М ацетате аммония, рН 3,5. Скорость элюции 1 мл/мин. В качестве детектора используют спектрофотометр хроматографа Altex 332. Фракцию, содержащую меченный тритием пептид, лиофилизируют и разбавляют метанолом до радиоактивной концентрации 1 мКи/мл. По данным хроматографии и жидкостного сцинтилляционного счета определяют химический выход продукта, общую радиоактивность и молярную активность. Получают 560 мкг меченного тритием пептида с общей радиоактивностью 2,5 мКи, и молярной активностью 25000 мКи/ммоль. Химический выход продукта 28% .
При хроматографировании в тонком слое на Silufol-254 установлены следующие значения Rf для полученного соединения: Rf 0,21, изобутанол: ацетон: аммиак = 15: 9: 9; Rf 0,36, бутанол: уксусная кислота: вода = 3: 1: 2.
Аминокислотный состав пептида: Tyr (0,90), Ala (0,95), Gly (1,1), Phe (0,90), Leu (1,0).
Анализ включения тритиевой метки проводят двумерной тонкослойной хроматографией кислых гидролизатов пептида в системе изобутанол: ацетон: аммиак= 15: 9: 9 (А) и изопропанол: вода: муравьиная кислота = 20: 5: 5 (Б). Тритиевая метка включается в пептид селективно. В С-концевой аминокислоте D-лейцине содержится 90% радиоактивной метки. Выделенную аминокислоту анализируют на содержание L-изомера с помощью лигандообменной хроматографии на оптически активной смоле. Введение тритиевой метки не сопровождается рацемизацией.
П р и м е р 9. В ампулу для изотопного обмена объемом 7 мл загружают 30 мг гетерогенного катализатора, содержащего 5% палладия на BaSO4, 1,15 мг (5,5 мкмоль) PhCl3, 1,0 мл диметилацетамида и 2 мг (5,5 мкмоль) пептида Pyr-His-ProNH2. Ампулу с раствором замораживают жидким азотом, вакуумируют до давления 1 ˙10-3 гПа и заполняют газообразным тритием до давления 400 гПа. Реакцию изотопного обмена проводят 3 ч при комнатной температуре.
Выделение и очистку продукта проводят, как описано в примере 8. Получают 240 мкг меченного тритием пептида с общей радиоактивностью 8 мКи и молярной активностью 12000 мКи/ммоль. Химический выход 12% .
При хроматографировании в тонком слое установлены следующие значения Rf для полученного соединения: Rf 0,41, Silufol UV-254, изобутанол: ацетон: аммиак = 15: 9: 9, Rf 0,25, Silufol UV-254, бутанол: уксусная кислота: вода = 3: 1: 2.
Аминокислотный состав полученного пептида: Pyr (0,98), His (0,90), Pro (0,95).
По результатам двумерной тонкослойной хроматографии продуктов кислотного гидролиза определяют место включения трития: 72% радиоактивности содержится в пролине и 28% радиоактивности - в гистидине.
П р и м е р 10. В ампулу для изотопного обмена объемом 7 мл загружают 10 мг гетерогенного катализатора, содержащего 5% палладия на BaSO4, 0,2 мг (1,0 мкмоль) PhCl3, 0,2 мл воды и 2 мг (1,0 мкмоль) пептида Arg-Gly-Asp-Pro-Glu-Val-Leu-Ala-Glu-Lys-Ala-Arg-Trp-Leu. Ампулу с раствором замораживают жидким азотом, вакуумируют до давления 1 ˙10-3гПа и заполняют газообразным тритием до давления 400 гПа. Реакцию изотопного обмена проводят 3 ч при комнатной температуре. Продукт выделяют и удаляют лабильный тритий, как описано в примере 8. Очистку продукта проводят на колонке 400х10 мм, упаковывают сорбентом КМ-Sefadex-25. Элюент: 0,5% -ный ацетат аммония, рН 5,2. Скорость элюирования 30 мл/ч. В качестве детектора используют проточный фотометр "Uvicord-S". Фракцию, содержащую меченный пептид, лиофилизируют и разбавляют 20% -ным водным этанолом до радиоактивной концентрации 1 мКи/мл. Получают 160 мкг меченного тритием пептида с общей радиоактивностью 160 мкКи и молярной активностью 1000 мКи/ммоль.
При хроматографировании в тонком слое установлены следующие значения Rf для полученного соединения: Rf 0,1, Silufol UV-254, изобутанол: ацетон: аммиак= 15: 9: 9; Rf 0,08, Silufol UV-254о, бутанол: уксусная кислота: вода = 3: 1: 2.
Аминокислотный состав пептида: Arg (0,95), Gly (1,0), Asp (0,98), Pro (1,0), Glu (0,95), Val (0,95), Ala (0,90), Lis (0,95).
По результатам двумерной тонкослойной хроматографии продуктов кислотного гидролиза определяют место включения трития: более 90% радиоактивности содержится в лейцине.
П р и м е р 11. В ампулу для изотопного обмена объемом 7 мл загружают10 мг гетерогенного катализатора, содержащего 5% палладия на BaSO4, 0,2 мг (1,0 мкмоль) PhCl3, 0,2 мл воды и 1,2 мг (1,0 мкмоль) пептида Ser-Asu-Ala-Cys-Lys-Arg-Glu-Pro-Gly-Ser-Glu-Phe.
Ампулу с раствором замораживают жидким азотом, вакуумируют до давления 1 ˙10-3 гПа и заполняют газообразным тритием до давления 400 гПа. Реакцию изотопного обмена проводят 3 ч при комнатной температуре. Продукт выделяют и удаляют лабильный тритий, как описано в предыдущих примерах. Очистку продукта проводят на колонке 400х10 мм упакованной сорбентом КМ-Sephadex-25. Элюцию осуществляют водой, скорость элюирования 30 мл/ч. Фракции, содержащие меченный пептид, объединяют и лиофилизируют. Получают 0,6 мг (химический метод 50% ) меченного тритием пептида общей радиоактивностью 400 мкКи и молярной активностью 800 мКи/ммоль.
П р и м е р 12 (сравнительный). В ампулу объемом 7 см3 помещают 2 мг (3,5 мкмоль) Tyr-DAla-Gly-Phe-DLeu, 20 мг гетерогенного катализатора, 5% Pd/BaSO4 и 0,5 мл фосфатного буфера рН 8,6. Реакцию изотопного обмена проводят с 100% -ным тритием в течение 5 ч при 25оС и давлении газообразного трития 400 гПа.
Очистку пептида после обработки газообразным тритием проводят так же, как описано в примере 1. В результате получают 1,4 мг меченного тритием пептида (химический выход 72% ) с молярной активностью 430 мКи/ммоль.
Предлагаемый способ гетерогенного изотопного обмена позволяет вводить тритиевую метку в линейные пептиды любого аминокислотного состава. Метка вводится в основном в концевую аминокислоту, что дает возможность следить за сохранностью первичной структуры пептида в физиологических условиях, введя, например, с N-конца углеродную метку.
Технология введения метки в предлагаемом способе: проведение изотопного обмена комплекса пептид-металлы платиновой группы на гетерогенных палладиевых катализаторах без растворителя в широком диапазоне температур (от комнатной до 50-100оС) позволяет значительно (в 1,2-50 раз) повысить молярную радиоактивность препаратов, избежать включения трития в растворитель.
Основной характеристикой меченных тритием препаратов и процессов их получения является молярная радиоактивность этих препаратов, так как она определяет аналитический уровень их обнаружения. На основании последнего судят о возможности использования меченных тритием препаратов в исследованиях по физико-химической биологии для решения самых разнообразных задач.
(56) Петреник Б. А. , Золотарев Ю. А. , Мясоедов Н. Ф. Получение меченных тритием аминокислот и пептидов гетерогенным изотопным обменом с газообразным тритием в растворе. Биоорганическая химия. 1983, 9. N 8, с. 1021.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МЕЧЕННЫХ ТРИТИЕМ ЛИНЕЙНЫХ ПЕПТИДОВ И ГЛИКОПЕПТИДОВ путем реакции изотопного обмена с газообразным тритием в присутствии гетерогенного палладиевого катализатора при пониженном давлении, отличающийся тем, что, с целью повышения молярной активности, процесс ведут в присутствии солей металлов платиновой группы при эквимолярном соотношении пептида и металла и температ
ре 20-1000oC.
