Изобретение относится к меченным тритием пептидам, конкретно к новому способу получения кратномеченного тритием гексапептида с равномерным распределением тритиевой метки по α -аминокислотным фрагментам формулы [3H] Гли-Лей-Лей-Асп-Лей-Лиз, который может быть использован в качестве лиганда для рецепторного связывания по опытному типу.
Целью изобретения является разработка способа получения новых меченных тритием пептидов с равномерным распределением тритиевой метки по α -аминокислотным фрагментам.
П р и м е р 1. В ампулу объемом 38 мл загружают 3000 мкг (4,5 мкмоль) пептида Гли-Лей-Лей-Асп-Лей-Лиз. 11200 кг (27 мкмоль хлорплатината (II) калия, 1 мл воды (константы исходного пептида: tпл - 131-133оС; [ α ] D22 = 41,3.
После растворения компонентов реакционный раствор нагревают до 50оС и выдерживают в течение 1 ч при этой температуре. Порциями по 5 мкл оттитровывают выделяющиеся в результате реакции комплексообразования протоны 0,1 М раствором гидроокиси натрия. Всего добавляют 45 мкл (4,5 мкмоль) щелочи за 30 мин. Полноту завершения реакции комплексообразования контролируют с помощью УФ-спектроскопии.
В раствор комплекса пептида добавляют 140 мг катализатора 5% -ного родия на окиси алюминия, после чего суспензию высушивают. Ампулу вакуумируют до давления 10-2 гПа и заполняют газообразным тритием до давления 400 гПа. Реакционную смесь нагревают до 140оС и выдерживают при этой температуре в течение 1 ч. По окончании реакции газообразный тритий удаляют, реакционную смесь суспендируют в 3 мл метанола и переносят на пористый фильтр. Осадок отделяют фильтрованием и там же промывают двумя порциями метанола по 10 мкл. Объединенный фильтрат упаривают и растворяют в 1 мл 50% -ного метанола.
Продукт очищают высокоэффективной жидкостной хроматографией на колонке "mBondapack 9x300 mm" в градиенте водный 0,1% -ный раствор трифторуксусной кислоты: ацетонитрил (0-25% ). Хроматографическое удерживание исходного и меченого пептида составляет 25,0 мин, спектральное отношение поглощения на длинах волны 206 и 226 нм в обоих случаях составляет 6,6 (см. фиг. 1 и 2).
Фракцию, содержащую меченный тритием пептид, лиофильно высушивают и разбавляют метанолом дорадиоактивной концентрации 37 ГБк/моль. Хроматографические и спектральные свойства кратномеченого пептида соответствуют свойствам исходного пептида. Получают 1770 мкг (2,67 мкмоль) кратномеченного тритием пептида с общей радиоактивностью 1610 ГБк/моль с химическим выходом 59% . По результатам ТСХ на Силуфоле Rf исходного и меченого пептида составляет 0,20 в системе бутанол: уксусная кислота: вода = 5: 2: 1: Rf = 0,35 в системе хлороформ: метанол: аммиак = 6: 4: 1.
Анализ распределения трития по молекуле проводят с использованием гидролиза пептида. 0,185 ГБк кратномеченого пептида ферментативно гидролизуют с помощью пептидазы Х (Серва) в 50-ммолярном трисацетатном буфере при рН 7,0 в течение 30 мин при 37оС. Смесь аминокислот отфильтровывают на пористом фильтре Амикон М-2 от белка, упаривают и наносят на пластину "Силуфол" 200х200 мм. Проводят двумерную хроматографию в системе А - хлороформ: метанол: аммиак (4: 6: 1) и а в системе Б - трет-бутанол: уксусная кислота (8: 2). Анализ распределения радиоактивности проводят на позиционно-чувствительном анализаторе "Уран" - PD-01-1. Расчет дал следующее распределение радиоактивной метки по пептидной цепи, приведенное в табл. 1.
Для определения положения радиоактивной метки в пределах аминокислоты, находящейся в α-положении аминокислотных фрагментов, проводят обработку аминокислотного гидролизата рацемизующей смесью трифторуксусный ангидрид - трифторуксусная кислота (60: 40). Для этого 0,037 ГБк гидролизата аминокислот обрабатывают 5 мл рацемизующей смеси при кипячении в течение 1 ч. Раствор упаривают досуха и определяют остаточную радиоактивность, которая составляет 0,0037 ГБк/моль. Это соответствует тому, что в среднем в α -положении аминокислот находится 90% радиоактивности. Таким образом, способ позволяет получать кратномеченный тритием пептид с распределением радиоактивной метки по всем α-аминокислотным фрагментам, анализировать в биологических пробах не только пептид, но и фрагменты его биодеградации, что не позволяют меченые пептиды по одной аминокислоте, например 125I-Тир.
В табл. 2 даны примеры 2-9 температурной зависимости включения изотопа.
Проводят реакцию комплекса пептида с платиной (II) по примеру 1 при 100-180о в течение 40 мин; результаты сведены в табл. 1.
П р и м е р 10 (сравнительный). Синтез [3H] Гли-Лей-Лей-Асп-Лей-Лиз по примеру 1, но в качестве катализатора используют 5% -ный палладий на сульфате бария. Получают 2070 мкг меченного тритием пептида с молярной активностью 172 КБк/моль.
П р и м е р 11 (сравнительный). Синтез гексапептида проводят по примеру 1, но для выделения используют хроматографию на силикагельной колонке Separon SGX (5 мкм); элюент-этанол, содержащий 1,5% -ный триэтиламин. Удерживание К'- 5,0. Выделяют меченый пептид с радиохимической чистотой 65% и выходом 85% .
Таким образом, способ позволяет получать кратномеченный тритием по α -положению аминокислотных фрагментов гексапептид, который можно использовать в качестве лиганда для рецепторного связывания по описанному типу, что не позволяют известные способы. (56) Авторское свидетельство СССР N 1436455, кл. С 07 В 59/00, 1986.
Изобретение относится к меченым соединениям, в частности к получению кратномеченным тритием по a -положению аминокислотных фрагментов гексапептида ф-лы [3H] Гли-Лей-Лей-Асп-Лей-Лиз, который может быть использован в качестве лиганда для рецепторного связывания по опиатному типу. Цель - разработка способа получения указанных соединений. Получение ведут обработкой пептида хлорплатинатом (2+) калия. Полученный комплекс пептида наносят на катализатор 5% Ph/Al2O3 и проводят изотопный обмен газообразным тритием при 130 - 150С с очисткой продукта жидкостной хроматографией. 2 ил. , 2 табл.
СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ КРАТНОМЕЧЕННОГО ТРИТИЕМ ПО α-ПОЛОЖЕНИЮ АМИНОКИСЛОТНЫХ ФРАГМЕНТОВ ГЕКСАПЕПТИДА формулы [3H] Гли-Лей-Лей-Асп-Лей-Лиз, заключающийся в том, что исходный пептид обрабатывают хлорплатинатом (II) калия, полученный комплекс пептида наносят на катализатор 5% -ный Ph/Al2O3 и проводят изотопный обмен газообразным тритием при 130 - 150oС и с очисткой продукта высокоэффективной жидкостной хроматографией.
