Способ идентификации генотипов многолетних злаков трибы пшеницевые (ТRIтIсеае) Советский патент 1990 года по МПК A01H1/04 

(21) 16 /31-13

(22)02.11.87

) 28.02.90. Бюл. If 8

(71)Центральный сибирский ботанический сад СО АН СССР

(72)А.В. Агафонов и О.В. Агафонова (53) 575.633.112.1(088.8)

(56)Созинов А.А. Полиморфизм белков и его значение в генетике и селекции. П., Наука, 1985.

( СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОТИПОВ МНОГОЛЕТНИХ ЗЛАКОВ ТРИБЫ ПШЕНИЦЕВЫЕ (TRITICEAE)

(57)Изобретение относится к биотехнологии, в частности к проблеме маркирования белками генетических систем

растений и использования белковых маркеров в решении актуальных вопросов прикладной ботаники, генетики, селекции. Целью изобретения является увеличение точности анализа мелких семян многолетних кормовых злаков. Способ состоит в том, что проламины извлекаются из семян в результате замачивания зерновок в дистиллированной воде, отделения препаровальными иглами зародыша, выдавливания полужидкого эндосперма с последующей экстракцией в 5-10 мкл экстрагирующего раствора, з электрофорез осуществляется в вертикальных пластинах полнакриламидно- го геля толщиной 1 мм, и экстракт наносится в стартовый карман слоем 0,5-0,8 мм. 1 табл.

г

(Л

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к проблеме маркирования белками генетических систем растений и использования белковых маркеров в решении актуальных вопросов прикладной ботаники, генетики, селекции. Целью изобретения является увеличение точности анализа мелких семян многолетних кормовых злаков. Способ состоит в том, что проламины извлекаются из семян в результате замачивания зерновок в дистиллированной воде, отделения препаровальными иглами зародыша, выдавливания полужидкого эндосперма с последующей экстракцией в 5-10 мкл экстрагирующего раствора, а электрофорез осуществляется в вертикальных пластинах полиакриламидного геля толщиной 1 мм, и экстракт наносится в стартовый карман слоем 0,5-0,8 мм. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к проблеме маркирования белками генетических систем растений и использования белковых маркеров в решении актуальных вопросов прикладной ботаники, генетики, селекции.

Цель изобретения - увеличение точности анализа мелких семян.

Способ осуществляется следующим образом.

Очищенные от цветочных чешуи зерновки размачивают в дистиллированной воде в течение суток. Препаровальной иглой удаляют зародыш и выдавливают полужидкую массу эндосперма с помощью тонкого стержня, прокатывая им с вершины зерновки до ее основания. По- лученный изолированный эндосперм с

массой 0,2-1 мг, отделенный от оболочки и зародыша, содержит все запасные белки без примесей, образующихся при размоле зерновки и составляющих 20-60% ее массы. Отсутствие примесей дает возможность проводить экстракцию белков в более жестких условиях в течение 12-18 ч при 40°С в 5-Ю мкл 70% этансла или 50% изопропанола в герметичных микропробирках. Указанная последовательность операций позволяет провести наиболее полную экстракцию проламиновой фракции запасных белков. После центрифугирования получают мкл концентрированного экстракта, который смешивают в соотношении 2:1 с электродным буфером электрофоретической системы, содержащим 60% сахарозы, и вторично центСЛ

4Ь

О

О

to to

рифугируют. Приготовленный экстракт подвергают электрофоретическому разделению в вертикальной пластине 1-миллиметрового полнакриламидного геля, при этом высокая концентрация проламиновых белков в экстракте позволяет наносить в стартовый карман тонкий слой экстракта 0,,8 мм. Этим достигается значительное повышение разрешающей способности элек- трофоретического метода. Ширина стартового кармана существенной роли не играет и может варьировать в пределах мм. Термостатирование геле- вой пластины в процессе электрофореза при 8-12°С позволяет повысить напряженность электрического поля до В/см и сократить время разделения белков в пластине длиной 12 см до 2,5 ч. Способ позволяет проводить индивидуальный анализ мелких зерновок многолетних кормовых злаков с массой менее 5 мг для идентификации сортов и видов, экотипов и форм. Кро ме того, появляется возможность анализировать электрофоретические спектры проламинов у гербарных образцов, собранных десятки лет назад, что становится необходимым Ъри установлении филогенетических взаимоотношений. Размачивание зерновки в дистиллированной воде, удаление препаровальной иглой зародыша и выдавливание с помощью тонкого стержня полужидкой массы эндосперма обеспечивает анализ индивидуальных зерновок маленьких размеров. Полученный таким способом изолированный эндосперм, содержащий все запасные белки без примесей, при годен для экстракции и дальнейших процедур, связанных с разделением белков в модифицированной электро- форетической системе.

Способ иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Имеются семена кормового шлака пырейника новоанглийского (пырея бескорневищного) сорта Первомайский и образцы семян из природных популяций двух таксономических видов рода пырейник (п.шероховат ост еб ель ный и п.новоанглийский), различающихся незначительным морфологическим признаком (степень опуше ности колоскового членика). Предварительный морфологический анализ сортовых семян показывает, что среди ни часть следовало бы отнести к одному

0

S

0

5 -JQ Q

д,

35

виду, а часть - к другому, а также выделить ряд промежуточных форм с неясной видовой принадлежностью.

В опыте ставится задача сравнить проламиновые спектры двух таксономических видов, каждый из материала сорта первомайский и из двух отдаленных мест дикого произрастания с тем, чтобы оценить правомерность разделения указанных видов на основе незначительных морфологических отличий .

Выборки зерновок из каждого указанного в таблице образца после отделения цветочных чешуи помещались в водяные камеры на 24 ч.

Кроме того, для объективного сопоставления электрофоретических спектров, полученных в серии опытов, в качестве стандартного маркера анализируются по 2 зерновки пырейника сибирского с известным компонентным составом спектра.

С размоченных зерновок удаляют избыток воды фильтровальной бумагой, препаровальной иглой отсекают зародыш и через отверстие в оболочке выдавливают полужидкий эндосперм, прокатывая с противоположного конца зерновки тонким стержнем из нержавеющей стали. Этим же стержнем изолированный эндосперм, составляющий у пырея бескорневищного 0,,6 мг, помещают в полиэтиленовую микропробирку с 8 мкл 50% изопропанола, гомогенизируют, закрывают герметичной пробкой и помещают в термостат с температурой АО С на 12-15 ч. По истечении времени микропробирки охлаждают до комнатной температуры, взмучивают осадок тупой иглой и центрифугируют 5 мин при 12000 и, Супернатант по возможности полностью отсасывают микропи- пет кой и смешивают в соотношении 2:1 с алюминий-лактатным буфером рН 3,1, содержащим 60% сахарозы и краситель пиронин, после чего образцы вторично центрифугируют 15 мин при 12000g.

Для электрофоретического разделения проламинов применяют однородную гелево-буферную систему с вертикальными пластинами 1-миллиметрового 9%-ного полиакриламидного геля на алюминий-лактатном буфере рН 3,1. Одновременно анализируются 2k пробы, которые наносят под слой электродного буфера в количестве 2 мкл. Электрофорез проводят при напряжении

ЙО в в течение 2,5 ч, охлаждая ге- левую пластину накладными оргстеклян- ными холодильниками с циркулирующей водой при 10-12°С. Гели фиксируют в 12%-ной трихлоруксусной кислоте (ТХУ) и окрашивают 0,1Ј-ным красителем Кумасси - 250 мл. в 12% ТХУ в течение 18-20 ч, не снимая со второго стекла. Окрашенные гели дифференцируют 7%-ной уксусной кислотой и фотографируют в проходящем свете.

В спектрах изученных образцов пырейника присутствует пт 13 до 19 компонентов разной интенсивности. При этом около половины компонентов с определенной частотой встречается во всех изученных природных и сортовых образцах.

Ряд компонентов распределен случайным образом, независимо от морфологии колоскового членика, некоторые компоненты спектра характерны только для определенного природного экотипа.

На основании ранее установленных закономерностей распределения прола- миновых компонентов у дикорастущих злаков пшеничной трибы можно считать, что представители разных биологических видов не могут иметь в составе проламиновых спектров идентичные совокупности компонентов. Таким образом все изученные образцы пырейника следует отнести к одному виду - п.шеро- ховатостебельный.

Пример 2. Имеется партия семян многолетнего кормового злака пшеницевой трибы с утерянными сортовыми свидетельствами. В состав пшеницевой трибы входит 9 родов многолетных злаков, включая важные в кормовом отношении, такие как пырей, пырейник, житняк, колосняк, ломкоколос- ник и т.д. Сходное строение зерновки позволяет применять описанную методику идентификации компонентов проламина, (преобладающего запасного белка зерновки), основанную на предлагаемом способе, как единую для всех

0

5

0

5

0

5

0

5

представителей трибы. Для точного определения сортовой принадлежности необходимо провести электрофорети- ческое разделение белкового экстракта эндосперма серии семян неизвестного образца и полученные спектры сравнить с аналогичными спектрами известных сортов.

Таким образом, предлагаемый способ дает возможность провести паспортизацию существующих сортов кормовых злаков трибы пшеницевые.а также контролировать все этапы селекционного процесса, апробации и районирования при создании новых хозяйственно ценных форм, значительно снизив экономические затраты на многие процедуры, позволяет достоверно анализировать природные экотипы дикорастущих пшеничных злаков, представ.- ляющих большой интерес для интродукции, а также идентифицировать гер- барные образцы, содержащие семена (независимо от сроков хранения), в целях уточнения внутри- и межвидовых филогенетических связей в трибе.

Формула изобретения

Способ идентификации генотипов многолетних злаков трибы пшеницевые (Triticeae), включающий приготовление экстракта проламинов, электро- форетическое разделение проламинов в вертикальных пластинах полнакрил- амидного геля, отличающий- с я тем, что,с целью увеличения точности анализа мелких семян, экстракт проламинов готовят из изолированного эндосперма, полученного путем размачивания семян в дистиллированной воде с последующим удалением зародыша, выдавливанием полужидкой массы эндосперма и экстракцией в мкл экстрагирующего раствора, а электрофорез проламинов проводят на пластинах геля, толщиной 1 мм с нанесением в стартовый карман экстракта слоем 0,,8 мм.