Способ определения модификационных изменений белкового комплекса зерна Советский патент 1992 года по МПК G01N33/02 A01H1/04 

Изобретение относится к биотехнологии, а именно генетическим исследованиям зерновых культур, и может быть использовано для оценки сорто- образцов, различающихся по качеству зерна.

В процессе биосинтеза белки могут быть модифицированы сопутствующими небелковыми веществами (углеводы, липиды, гликолипиды). Процесс модифи- кационных изменений затрагивает основной компонент белкового комплекса - проламин, который является маркером генома и выполняет запасную функцию в зерне. Вместе с тем и небелковые вещества играют важную роль в формировании белковых структур, например, гликолипиды в формировании

уникальной структуры клейковины, определяющей технологические свойства пшеницы. Использование добавок в пшеничную муку улучшает качество хлебопродуктов. Имеющиеся данные свидетельствуют о генетической специфичности модификации в процессе биосинтеза проламинов, что приводит к изменениям показателей, определяющих качество зерна. В связи с этим разработаны различные способы определения кодификационных изменений белкового комплекса зерновых культур.

Известные способы включают экстракцию проламинов и определение содержания углеводов, суммарных липидов, гликолипидов или качественного состава липидной компоненты. Для опреде 1

оэ со ю

00

4

дения генетической специфичности зерновых культур к модификационным изменениям используют способ, согласно которому проводят SDS-электрофорез или изоэлектрофокусирование комплекса проламиновых белков в полиакрил- амидном геле. Электрофореграмму обрабатывают конкавалином А, меченым радиоактивным изотопом иода-125. По специфичности связывания отдельных полипептидов с конкавалином А определяют зависимость процесса гликози- лирования от исходного генотипа, К основным недостаткам указанных способов следует отнести трудоемкость и длительность операций по подготовке образца и проведение анализа с использованием набора дефицитных реагентов, которые специфичны для каждого определяемого компонента.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому эффекту к предлагаемому является способ, включающий экстракцию проламиновых белков из зерна с различным генотипом, проведение электрофореза в полиакрил- амидном геле, окрашивание гелей цве- тореагентом и определение модифика- ционных изменений белков по данным денситометрии.

Согласно известному способу экстрагируют проламин из селекционных образцов зерна раствором 70%-ного этанола с 2М мочевиной. -Затем проводят электрофоретическое разделение выделенных белковых препаратов в плоском полиакриламидном геле с 8 i мочевиной в уксуснокислой системе, а также в 12,5%-ном полиакриламидном геле с 0,1% додецилсуль- фата натрия в щелочных буферных растворах. После электрофореза гели окрашивают с помощью Шифф-иодной кислоты для выявления углеводов, используя 12 операций в такой последовательности: обработка 100 мл 10% раствора трихлоруксусной кислоты в течение 30 мин; промывка дистиллированной водой по 200 мл (2 раза по 30 мин); обработка 100 мл 1,1%-ного раствора медной кислоты, приготовленной на 0%-ном этаноле, в течение 30 мин; промывка дистиллированной водой (2 раза по 200 мл в течение 5 -мин; выдержка в течение k мин в 100 мл восстанавливающего раствора (АО мл 5%-ного раствора йодистого калия,

растворенного в 5%-ном растворе гипо0

0

сульфита натрия и 60 мл 3,5 мМ раствора соляной кислоты); повторная обработка в 100 мл свежеприготовленно- го восстанавливающего раствора в течение мин; обработка дистиллированной водой 3 раза; инкубирование в 100 мл реактива Шиффа g течение 90 мин; обработка 200 мл обесцвечивающего раствора (0,2% метабисульфи- та натрия, kQ% этанола и 5% уксусной кислоты) в течение 90 мин при 55РС; промывка (2 раза по 100 мл) раствором, содержащим №%, этанола и 5% ук- j сусной кислоты, в течение 30 мин; обработка 200 мл 0,8%-ного раствора ме- табисульфита натрия, приготовленного на 0,12 М соляной кислоте, до полного обеспечивания фона; фиксирование в 5%-ном растворе уксусной кислоты.

Оптическую плотность окрашенных зон получают путем сканирования гелей на денситометре и по полученным значениям определяют модификационные изменения белкового комплекса зерна.

Указанный способ сложен в техническом исполнении, отличается длительными и трудоемкими методиками, требует большого расхода дефицитных реагентов (более 10) и предусматривает подготовку сложных растворов (более 10). К недостаткам способа следует также отнести и необходимость проведения электрофоретического разделения комплекса проламиновых белков на группы полипептидов перед определением оптических параметров. Указанные недостатки ограничивают использование способа в селекционной практике для экспресс-диагностики.

Цель изобретения - упрощение и : ускорение анализа.

Способ осуществляют следующим образом.

5

0

5

0

1

Экстрагируют белки проламинового комплекса из размолотого зерна стандартного и исследуемого сортообраз- ца злаковых культур. Проводят подготовку препарата проламина к анализу путем отливки пленки из раствора на оптическое стекло. Измеряют инфракрасный спектр проламина на спектрофотометре в области 1550-1850 определяют значения оптической плотности в максимумах поглощения при 17Ю-1730 и 1650-1660 рассчитывают соотношение оптических плотностей при указанных максимумах в качестве сравнительного показателя. Повышение степени модификации белкового комплекса выявляют по возрастанию величины сравнительного показателя исследуемого сортообразца в сравнении со стандартным. Интервал значений волновых чисел максимумов поглощения при 1710-1730 и 1650-1660 обоснован экспериментально.

На чертеже приведены спектры поглщения зерна стандартного (линия кукурузы +/+ - кривая 1) и исследуемого (мутантная линия кукурузы 02/02 - кривая 2) сортообразцов

Отличительными особенностями способа являются анализ по спектру поглощения проламина и определение степени модификационных изменений белкового комплекса зерна по величине отношения оптических плотностей в максимумах поглощения проламина исследумого сортообразца в сравнении со стандартным.

Пример 1. Исследуют ИК-спект ры глиадинов, выделенных экстракцией 70%-ным этанолом после отделения во- до- и солерастворимых белков из размолотого зерна сортов пшеницы, контрастных по технологическим свойствам - Коралл Одесский (твердая) и Днепропетровская (мягкая), Для подготоки тонкой пленки образца к анализу раствор 3 мг препарата в 0,5 мл 70%-ного водного диоксана наносят на оптическое стекло из флюорита и высушивают под вакуумом. ИК-спектры глиадинов получают на приборе Спекорд М-80 в области 1550-1850 . Оптические плотности 0,и DZ. в максимумах поглощения при , и )2 рассчитывают по методу базисной линии.

Значения сравнительного показателя глиадинов приведены в табл. 1 (данные статистически достоверны, ошибка измерения не более 5%)

Значения сравнительного показателя свидетельствуют о возрастании модификационных изменений белков проламинового комплекса зерна пшени-

цы мягких сортов в сравнении с сор- тосбразцом твердых пшениц.

П р и м е р 2. Исследуют ИК-спектры проламинов, выделенных из зерна злаковых культур, аналогично примеру 1.

Результаты определения сравнительного показателя D«/Da. проламинов приведены табл. 2 (данные стати

)

стически достоверны, ошибка измерения не более 5%)

Вариабельность сравнительного показателя свидетельствует о зависимости степени модификационной изменчивости проламинового комплекса от природы зерновых культур.

П р и м е р 3. Исследуют аналогич- .но примеру 1 ИК-спектры белков зеи- нового комплекса, выделенных из зерна кукурузы с различным генотипом путем экстракции раствором 70%-ного этанола с В-меркаптоэтанолом. 8 качестве стандарта используют исходное линии кукурузы (W6AA +/+, А 619 +/+), а в качестве исследуемых образцов - линии кукурузы с эндоспермовыми мутациями типа о2, su2, o2/o2, ди2/ /su2.

Результаты определения сравнительного показателя D,/D зеинов приведены в табл. 3 (данные статистически достоверны, ошибка измерения не более 5%).

5

Полученные результаты подтверждают, что сравнительный критерий позволяет определить степень модификационных изменений белкового комплекса в зависимости от типа эндоспермовой мутации.

Так, мутация типа о2/о2 вызывает существенные изменения в процессах модификации белков в отличие от мутации типа su2/su2. В двойных мутациях типа о2/о2 su2/su2 наблюдается снижение модификационных изменений в сравнении с мутацией типа о2/о2.

Использование предполагаемого способа в сравнении с известным позволит ускорить и упростить определение модификационных изменений белкового комплекса зерна путем исключения длительных и трудоемких операций, исключить расход многочисленных реагентов. Предлагаемый способ позволяет выявить сортовую и генотипи- ческую специфичность злаковых куль- тур к модификационным изменениям белкового комплекса при оценке качества зерна по хозяйственно ценным призна

55

кам. Формул

изобретения

Способ определения модификационных изменений белкового комплекса зерна, включающий экстракцию прола 1

мина исследуемых и стандартных сор- тообразцов злаковых культур и опреде ление модификационных изменений белка по оптическому параметру, о т- личающийся тем, что, с целью упрощения и ускорения анализа, в- качестве оптического параметра исследуют инфракрасный спектр прола- мина в области 1550-1850 опреде ляют значения оптических плотностей

92848

в,максимумах, находят отношение значения оптической плотности в максимуме при 1710-1730 значению , оптической плотности в максимуме при 1650-1660 см и по возрастанию данного отношения у исследуемых сортооб- разцов по сравнению со стандартными выявляют повышение степени модификаto ционных изменений.

Использование: сельское хозяйство, биотехнология, селекция и семеноводство. Сущность изобретения: изучают инфракрасный спектр пролами- на исследуемого и стандартного сор- тообразцов, определяют оптическую плотность в максимумах, рассчитывают отношение значения оптической плотности в максимуме при 1710-1730 см к значению оптической плотности в максимуме при 1650-1660 см и по возрастанию его у исследуемых образцов по сравнению со стандартными определяют степень модиЛикационных изменений . 1 ил. , 3 табл. Ј (Л

Т а б л и ц а 1

-----------j--„----- --р----

Сорт пшеницы I 3,, N2,

Коралл Одее-1

ский1730 1656 0,10

Днепровская- .8461730 1656 0,21

Таблица Характеристика проламинов I (,см |D«/D

СекаЛин (Рожь Харьковская 55)172016600,23 Проламин тритикале (Амфидиплоид 3/5)171016600,34

Авенин (Овес Скакун)17301&500,39

Кафирин (Сорго Судзерн 62)171216560,51

Таблица Генотип кукурузы j (, см |v2, CM f|Df/D

W64A +/+172516560,21

W64A о2/о2172416560,40

W64A su2/su2172516560,12

W64A о2/о2 su2/su2Т72516560,ТЗ

А 619 +/+172016560,22

А 619 о2/о2172016560,30

А 619 su2/su2172016560,19

А 619 о2/о2 su2/su2173016560,16

%