РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PLT 9, КОДИРУЮЩАЯ ПОЛИПЕПТИД СО СВОЙСТВАМИ ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА, РЕКОМБИНАНТНАЯ ПЛАЗМИДНАЯ ДНК PLT 16, ИСПОЛЬЗУЕМАЯ ДЛЯ КОНСТРУИРОВАНИЯ ДНК PLT 9, И ШТАММ БАКТЕРИЙ ESCHERICHIA COLI - ПРОДУЦЕНТ ПОЛИПЕПТИДА СО СВОЙСТВАМИ ЛИМФОТОКСИНА ЧЕЛОВЕКА Советский патент 1994 года по МПК C12N15/19 C12P21/02 C12N1/21 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и представляет собой сконструированные in vitro рекомбинантные плазмидные ДНК, содержащие полусинтетические гены лимфотоксина человека, промоторы ранней области бактериофага Т7 и синтетические участки инициации трансляции, обусловливающие биосинтез полипептидов с биологической активностью лимфотоксина человека, а также штаммы Escherichia coli - продуценты этих полипептидов.

Целью изобретения является увеличение уровня биосинтеза лимфотоксина.

Получены новая рекомбинантная плазмида pLT9, кодирующая конститутивный синтез полипептида со свойствами лимфотоксина человека, и штамм E.coli SG 20050/pLT 9, обеспечивающий уровень синтеза ЛТ 4 х 10⁵ед/мл клеточной суспензии при плотности клеток 10⁹ клеток/мл.

Рекомбинантная плазмидная ДНК pLT 9, кодирующая полипептид со свойствами лимфотоксина человека, характеризуется следующими признаками: кодирует аминокислотную последовательность, в которой первые десять аминокислот лимфотоксина человека заменены остатком Val, имеет мол.м. 2,64 МДа (4,06 т. п.о.), состоит из Hind III-Kpn I - фрагмента ДНК плазмиды p6A32, содержащего тандем промоторов A2 и A3 ранней области бактериофага Т7, ген β-лактамазы и терминатор транскрипции фага лямбда (3,4 т.п.о); Kpn I - Hind III - фрагмента, содержащего синтетический сайт инициации трансляции и полусинтетический ген лимфотоксина человека (0,65 т.п.о.), содержит в качестве генетического маркера ген β -лактамазы, детерминирующий устойчивость трансформированных плазмидой pLT 9 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам, уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях вправо от сайта Kpn I: Sal I 656 нуклеотидов, Hind III 668 нуклеотидов, Pvu II 816 нуклеотидов, NcoI 1229 нуклеотидов.

Рекомбинантная плазмида pLT 9 содержит полусинтетический ген лимфотоксина человека. Источником C-концевой части гена является часть четвертого экзона природного гена, представленная в плазмиде pLT 2,4 фрагментом FoK I - Hind III. Недостающая последовательность 60N-концевых аминокислот, была получена с помощью химико-ферментативного синтеза.

Для идентификации и выделения гена лимфотоксина клонотеку генов человека приготовляют из смеси высокомолекулярных ДНК, выделенных из нескольких индивидуальных плацент. Для этого ДНК гидролизуют рестрикционной эндонуклеазой Sau 3 AI и полученный гидролизат фракционируют электрофорезом в 0,8% -ном агарозном геле, выделяя зоны, содержащие ДНК 16-18 т.п.о., 18-20 т.п. о. и 20-22 т.п.о. ДНК фракций лигируют с предварительно дефосфорилированными большими фрагментами фагового вектора λ gt-WESB, которые выделяют после гидролиза фаговой ДНК эндонуклеазой Bam I. Препараты упакованных рекомбинантных фагов концентрируют центрифугированием в ступенчатом градиенте CsCl, после чего проводят трансфекцию клеток E.coli и высевают на чашки. Анализ полученной таким образом клонотеки проводят путем гибридизации амплифицированных ДНК на дуплицированных фильтрах HA-85 с олигонуклеотидными зонами. Для скрининга рекомбинантных фагов используют олигонуклеотиды
5' CTACTCCCAGGTGGTCT 3'
3' TCCACCAGAAGAGAC 5' , последовательность которых соответствует аминокислотной последовательности 76-82 зрелого лимфотоксина. Для увеличения удельной радиоактивной пробы олигонуклеотидные зоны сначала 5' -фосфорилируют с помощью ³²P - ATP, а затем достраивают выступающие концы с помощью фрагмента Кленова ДНК полимеразы E.coli и высокомеченных ³²Р-дезоксинуклеозид-5' - трифосфатов. Использование полученных таким образом зондов (удельной радиоактивности 10 имп/мин пмоль) позволяет идентифицировать фракцию ДНК, содержащую ген лимфотоксина. Из 1000000 клонов первичной скрининг выявил три положительных сигнала. Зоны, содержащие рекомбинантные фаги, вырезают с исходных чашек и после амплификации подвергают вторичному скринингу, используя дополнительно гибридизацию с олигонуклеотидными зондами
5' ACACCACCTGAACGTCTCTTC 3'
3' ACTTGCAGAGAAGGA GGGTTC 5' , соответствующими аминокислотной последовательности 2-11 пролимфотоксина. ДНК одного из рекомбинантных фагов, λLT, дававшего положительную гибридизацию со всеми олигонуклеотидными зондами, выделяют и анализируют с помощью блот-гибридизации по Саузерну, используя гидролизаты фаговой ДНК различными рестрикционными эндонуклеазами. Далее ДНК рекомбинантного фага λLT гидролизуют рестриктазой EcoRI, выделяют фрагмент величиной 2,4 т.п.о., содержащий ген ЛТ, и реклонируют его по сайту EcoRI в плазмиду pUC 12. В результате получают рекомбинантную pLT 2,4, в которой ген лимфотоксина человека находится в такой ориентации, что его транскрипция совпадает с транскрипцией α -пептида β-галактозидазы E.coli.

Далее четвертый экзон гена лимфотоксина клонируют в плазмиду pUR 289 по сайту рестриктазы Bam I. Для этого векторную плазмиду pUR 289 расщепляют эндонуклеазой Bam I и лигируют полученную таким образом линейную ДНК с фрагментом Sau 3A1 величиной 580 п.о., полученным из плазмиды pLT 2.4. После трансформации лигазной смесью клеток E.coli IM 101 отбирают синие, гибридизующиеся с олигонуклеотидным зондом (соответствующим аминокислотной последовательности 76-82 зрелого ЛТ), ампициллинустойчивые колонии, из которых выделяют плазмидную ДНК и подвергают ее рестриктному анализу эндонуклеазами Hae III и Msp I. Плазмиду, в которой рамка считывания четвертого экзона гена лимфотоксина совпадает с рамкой считывания β -галактозидазы E. coli, обозначают pLT 1.

Для получения 5' β -концевого фрагмента гена лимфотоксина человека синтезируют фосфорамидитным твердофазным методом двенадцать олигодезоксирибонуклеотидов величиной от 29 до 34 нуклеотидных звеньев. Лигазные сшивки проводят в два этапа: на первом этапе проводят три четырехкомпонентные сшивки, причем все олигонуклеотиды перед сшивкой фосфорилируют при помощи rATP и Т4 полинуклеотидкиназы за исключением 5'-концевого олигонуклеотида 1 из сегмента 1. На втором этапе сшивают Т4 ДНК лигазой сегменты 1+2+3, которые предварительно очищают электрофорезом 15% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Получившуюся в результате 188-звенную двухцепочечную ДНК очищают электрофорезом в 8% ПААГ. Сегмент 1
I P III AATTCTTATGCTCCCGGGTGTTGGCCTCACACCTTCAGCTGCCCAGACTGCCCGTCA GCA
GAATACGAGGGCCCACAACCGGAGTGTGGAAGTCGACGGGTCTCAGGGCCAGTCGTGGGGTTC
II P IV P
Сегмент 2
P V VII CCCCAAGATGCATCTTGCCCACAGCAACCTCAAACCTGCTGCTCACCTCATTGGAGACCCCAGC
TACGTAGAACGGGTGTCGTTGGAGTTTGGACGACGAGTGGAGTAACCTCTGGGGTCGTTCGTCT
VI P VIII P
Сегмент 3
P IX P XI AGCAGAACTCACTGCTCTGGAGAGCAAACAGGCACCGTGCCTTCCTCCAGGATGGTTTCTCCT
TGAGTGACGAGACCTCTCGTTTGTGCCTGGCACGGAAGGAGGTCCTACCAAAGAGGAACTC
X P XII P
Сборку полного гена лимфотоксина человека проводят в плазмиде pGEMI. Для этого ДНК плазмиды pGEMI расщепляют рестриктазами EcoRI и PstI, затем полученный вектор лигируют со 188-звенной синтетической ДНК и FoKI/Pst I - фрагментом, выделенным из плазмиды pLT 1 после гидролиза соответствующими эндоуклеазами. После трансформации компетентных клеток E.coli HB 101 скрининг нужных клонов проводят гибридизацией с ³²Р-меченными олигонуклеотидами III и TCCACCAGAAGAGAC на присутствие синтетического фрагмента гена и фрагмента четвертого экзона. Из клонов, гибридизующихся с обоими зондами, выделяют ДНК, анализируют ее рестриктивным анализом с помощью рестриктаз Hae III и Msp I и подтверждают структуру определением нуклеотидной последовательности модифицированным методом Максама-Гилберта (Dobrynin V.N., Korobko V. G. et al, Nucl. Acids Res., Symp. Ser. 1980, v. 7, p. 365-376). Затем полученную ДНК плазмиды pFP расщепляют рестрикционными эндонуклеазами Pst I и Hind III, выделяют больший фрагмент. С другой стороны, расщепляют теми же эндонуклеазами ДНК плазмиды pLT1, выделяют малый фрагмент величиной около 300 п.о. и лигируют с векторной молекулой. После трансформации компетентных клеток E. coli HB 101 проводят скрининг клонов, содержащих плазмиду pFPZ с полусинтетическим геном лимфотоксина человека, рестриктным анализом с помощью эндонуклеаз Hae III, Msp I и Pst I.

Использование при конструировании плазмиды синтетического 5'' -концевого фрагмента гена лимфотоксина человека при мультикомпонентной сборке плазмиды, использование для этой цели рестрикционной эндонуклеазы FoRI, а также гибридизация с двумя олигонуклеотидными зондами, соответствующими клонируемым фрагментам, позволяет однозначно отобрать бактериальные клоны, содержащие целевую плазмиду, что в значительной степени упрощает конструирование рекомбинантной плазмиды.

Плазмида pFPZ содержит полусинтетический ген лимфотоксина человека, не содержащий регуляторных участков (в частности, сайта инициации трансляции), необходимых для его экспрессии. Для конструирования плазмиды, экспрессирующей гент ЛТ, используют плазмиду PDSFvI (ДАН СССР, 1986, т. 288, N 3, с. 734-737) в качестве вектора после расщепления ДНК рестриктазой Bam I, достройки образовавшихся выступающих концов при помощи фрагмента Кленова ДНК полимеразы 1 E.coli в присутствии четырех дезоксинуклеозид-5' -трифосфатов и последующего гидролиза рестриктазой Hind III. Полученный таким образом вектор лигируют с фрагментом ДНК, содержащим полусинтетический ген лимфотоксина человека, полученным путем гидролиза ДНК плазмиды pFPZ рестриктазой EcoRI с последующей достройкой липких концов при помощи ДНК полимеразы 1 E. coli в присутствии четырех dNTPs и дополнительным гидролизом рестриктазой Hind III. В результате после трансформации клеток E.coli SG 20050 получают новую рекомбинантную плазмиду pLT 16, содержащую искусственный ген лимфотоксина человека, и необходимые для его экспрессии регуляторные участки. Клетки E. coli SG 20050, содержащие плазмиду pLT 16, продуцируют полипептид с цитотоксическими свойствами лимфотоксина человека, причем уровень биосинтеза ЛТ составляет 5 х 10³ ед/мл культуры при концентрации клеток 10⁸ клеток/мл суспензии.

Для усовершенствования системы экспрессии гена лимфотоксина человека и получения нового варианта гена ЛТ конструируют новую рекомбинантную плазмиду pLT 9, которая содержит усовершенствованный по сравнению с плазмидой pLT 16 рибосомосвязывающий участок и измененный искусственный ген лимфотоксина, кодирующий укороченный белок, в котором первые 10N-концевых аминокислот заменены остатком валина. Для этого сначала ДНК плазмиды pLT 16 гидролизуют рестриктазой EcoRI, затем линейную форму ДНК обрабатывают в контролируемых условиях последовательно экзонуклеазой III из E.coli и нуклеазой из золотистой фасоли (так, чтобы в среднем отщепилось 100 нуклеотидных пар), после чего гидролизуют рестриктазой Hind III и малый фрагмент (около 600 п.о.) выделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Векторный фрагмент получают следующим образом. Сначала ДНК плазмиды pTNF 33D (производная плазмиды pTNF 33, из которой удален Kpn I - фрагмент величиной 840 п.о.) гидролизуют эндонуклеазой XhoI, получившуюся линейную форму обрабатывают фрагментом Кленова ДНК полимеразы 1 E.coli в присутствии всех четырех дезонуклеозид-5 -трифосфатов для заполнения липких концов, после чего получившуюся ДНК подвергают дополнительному гидролизу рестриктазой Hind III и векторный фрагмент после очистки электрофорезом в 1%-ном агарозном геле лигируют с фрагментом, полученным из плазмиды pLT 16. После трансформации компетентных клеток E. coli частью лигазной смеси скрининг рекомбинантов проводят путем определения цитотоксической активности лизатов из колоний, устойчивых к ампициллину и хлорамфениколу, гибридизующихся с олигонуклеотидным зондом TCCACCAGAAGAGAC. В результате получают плазмиду pLT 9, строение которой подтверждают анализом рестрикционными эндонуклеазами Hae III и Msp I, а также определением нуклеотидной последовательности района инициации трансляции и N-концевой части гена ЛТ.

Для получения штамма-продуцента полипептида с биологической активностью лимфотоксина человека плазмидой pLT 9 трансформируют компетентные клетки E. coli SG 20050.

Полученный штамм E.coli SG 20050/pLT 9 характеризуется следующими признаками.

Морфологические признаки. Клетки мелкие утолщенной палочковидной формы, грамотрицательные, неспороносные.

Культуральные признаки. Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре "Дифко" колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте в жидких средах (на минимальной среде с глюкозой или B-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.

Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40^оС при оптимуме рН от 6,8 до 7,0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона, триптона, дрожжевого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода используют аминокислоты, глицерин, углеводы.

Устойчивость к антибиотикам. Клетки проявляют устойчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл) и хлорамфениколу (до 500 мкг/мл), обусловленную наличием плазмиды, а также к тетрациклину (до 500 мкг/мл) благодаря наличию транспозона.

Штамм E. coli SG 20050/pLT 9 обусловливает конститутивный синтез полипептида со свойствами лимфотоксина человека на уровне 4 х 10⁵ ед/мл клеточной суспензии, что составляет около 15% тотального клеточного белка бактерий.

П р и м е р 1. Химико-ферментативный синтез N-концевого фрагмента структурного гена лимфотоксина человека.

Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System I (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от 3' -конца к 5'-концу с помощью защищенных фосфамидитов-5'-диметокситритил-N-ацил-2'-дезоксинуклеозид-3' -0-(метоксидиизопропиламино)фосфитов, активированных тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0,5-0,7 мкмоль, используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 , размер частиц 40-80 мкм), к которому через 3' -сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют синтетический цикл, где после реакции конденсации проводят промывку смолы смесью тетрагидрофуран - пиридин - вода (5:3:2). После окончания синтеза защитные группы удаляют последовательной обработкой тиофенолятом триэтиламмония и концентрированным аммиаком. При этом происходит отделение олигонуклеотида от носителя. 5-Диметокситритильную группу удаляют кислотной обработкой и олигонуклеотид очищают электрофорезом в 20% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Выход 1-5 о.е.

Лигазная сшивка. Смесь 250 пмоль олигонуклеотида (I) и 200 пмоль каждого фосфорилированного олигонуклеотида (II), (III) и 250 пмоль фосфорилированного олигонуклеотида (I) нагревают 10 мин при 90^оС в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl, рН 7,5 и 10 мМ MgCl₂, затем медленно охлаждают до 15^оС, прибавляют rATR до концентрации 0,2 мМ, дитиотреит до концентрации 10 мМ и 100 ед Т4 ДНК-лигазы. Смесь инкубируют 6 ч при 15^оС, затем депротеинизируют двукратной экстракцией фенолом, ДНК высаживают этанолом и продукты сшивки выделяют при помощи электрофореза в 15% ПААГ, содержащем 7М мочевину. Очищенный продукт сшивки элюируют из геля электроэлюцией на DEAE-бумагу DE-81, которую промывают несколько раз TE-буфером (10 мМ трис-HCl, рН 8,0; 0,5 мМ EDTA) и этанолом. Нуклеотидный материал элюируют при помощи 1,5 М раствора NaCl в TE-буфере и обессоливают на колонке с сефадексом G-50. Выход сегмента 1 150 пмоль. Аналогичным образом получают сгементы 2 и 3. Выход 180 и 160 пмоль соответственно. Далее сшивают по 50 пмоль каждого сегмента 1, 2 и 3 в 20 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 10 мМ MgCl₂; 0,2 мМ rATR; 10 мМ дитиотреит (буфер) и 50 ед. Т4 ДНК-лигазы, 4 ч при 15^оС. Продукт сшивки выделяют электрофорезом в 8% ПААГ. Выход 30 пмоль. Структуру промежуточных и конечных продуктов лигазных реакций подтверждают анализом нуклеотидной последовательности.

П р и м е р 2. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pLT 1.

Клетки бактерий E.coli IM 101, содержащие плазмидную ДНК pUR 289, выращивают при 37^оС в LB-бульоне, содержащем 100 мкг/мл ампициллина, до стационарной фазы. Затем клетки выделяют с модификациями, заключающимися в том, что к супернатанту, полученному после подкисления ацетатом натрия, прибавляют РНКа-зу А до концентрации 10 мкг/мл, смесь инкубируют 20 мин при 37^оС, экстрагируют дважды смесью фенол - хлороформ (1:1) и ДНК высаживают этанолом. Осадок растворяют в ТЕ-буфере, содержащем 1 M NaCl, прибавляют полиэтиленгликоль (ПЭГ-6000) до концентрации 1,5%, выдерживают 1 ч при 0^оС центрифугируют 10 мин при 10000 об/мин; осадок промывают 70%-ным этанолом, высушивают и растворяют в ТЕ-буфере. Выход плазмидной ДНК определяют спектрофотометрически при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 бое/мг.

Аналогичным образом выделяют ДНК плазмиды pLT 2,4, содержащую ген лимфотоксина человека в виде EcoRI-фрагмента (2,4 т.п.о.), клонированный в плазмиде pUC 12 из рекомбинантного фага 2,4. Полученные препараты плазмидных ДНК используют для конструирования плазмиды pLT 1, которое проводят следующим образом: 5 мкг плазмиды pUR 291 инкубируют с эндонуклеазой рестрикции BamI (20 ед) в буфере R, содержащем 20 мМ трис-HCl, рН 7,5; 50 мМ NaCl; 10 мМ MgCl₂; 5 мМ меркаптоэтанола, 1 ч при 37^оС. После инкубации реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фенол - хлороформ (1:1). Анализ полноты гидролиза и выделение векторного BamI-фрагмента (5,3 т.п.о) проводят электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Одновременно 10 мкг плазмиды pLT 2.4 обрабатывают 1,5 ч при 37^оС в буфере R рестриктазой Sau 3AI (20 ед), после чего - электрофорезом в 5% ПААГ фрагмент четвертого экзона гена лимфотоксина. Далее этот фрагмент (0,2 мкг) соединяют с векторной ДНК (1,5 мкг) с помощью 30 ед Т4 ДНК лигазы в 50 мкл буфера L в течение 6 ч при 15^оС.

Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации клеток E. coli IM 101. Трансформацию проводят следующим образом. Предварительно клетки высевают на агар, содержащий среду М9, 0,2% глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единичную колонию вносят в 50 мл питательного бульона и выращивают при 37^оС до мутности 0,3-0,5. Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 мин, 5000 об/мин), промывают раствором 10 мМ MgCl₂, центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0,1 М раствора CaCl₂и выдерживают при 0^оС в течение 30 мин. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaCl₂ и через 3 ч используют для трансформации. С этой целью 5 мкл лигазной смеси смешивают с 50 мкл 0,05 M CaCl₂, затем прибавляют 150 мкл суспензии компетентных клеток, выдерживают при 0^оС, затем 2 мин при 42^оС и снова 10 мин при 0^оС, после чего прибавляют 1,4 мл LB-бульона, инкубируют 1 ч при 37^оС и аликвоты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл), X-Gal (40 мкг/мл) и 1 мМ IPTG. Полученные ярко-синие колонии переносят на параллельные нитроцеллюлозные фильтры и анализируют на содержание фрагмента гена лимфотоксина гибридизацией колоний in situ с ³²Р-меченным олигонуклеотидом TCCACCAGAAGAGAC. Колонии, дающие положительную гибридизацию, отбирают и выделенную из них плазмиду анализируют при помощи эндонуклеаз Hae III и MspI. Плазмиду, в которой направление транскрипции генов β -галактозидазы E. coli и лимфотоксина человека совпадает, обозначают pLT 1 и ее структуру подтверждают анализом нуклеотидной последовательности части плазмидной ДНК между сайтами EcoRI и Hind III.

П р и м е р 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pLT 16.

ДНК плазмиды pGEMI (Promega Biotec, 10 мкг) гидролизуют совместно эндонуклеазами рестрикции (по 20 ед каждой) EcoRI и PstI в 100 мкл буфера R в течение 1,5 ч при 37^оС. После инкубации смесь экстрагируют дважды смесью фенол - хлороформ (1:1) и векторный фрагмент величиной 2,88 т.п.о выделяют электрофорезом в 1%-ном агарозном геле. Затем 30 мкг ДНК плазмиды pLTI гидролизуют в том же буфере с помощью смеси 100 ед рестриктазы FoKI и 60 ед рестриктазы Pst I, после чего выделяют электрофорезом в 8% ПААГ фрагмент величиной 192 п.о., содержащий часть четвертого экзона гена лимфотоксина. После этого лигируют 0,1 мкг этого фрагмента с 0,2 мкг синтетической ДНК, описанной в примере 1, и 1 мкг EcoRI-PstI-фрагмента плазмиды pGEMI в 25 мкл буфера L в присутствии 50 ед Т4 ДНК лигазы. Через 3 ч при 15^оС 5 мкл лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток. После трансформации компетентных клеток E.coli HB 101 скрининг нужных клонов проводят гибридизацией с ³²Р-меченными олигонуклеотидами III и TCCACCAGAAGAGAC на присутствие синтетического фрагмента гена и фрагмента четвертого экзона. Из клонов, гибридизирующихся с обоими зондами, выделяют ДНК, анализируют ее рестриктным анализом с помощью рестриктаз Hae III и MspI и подтверждают структуру определением нуклеотидной последовательности модифицированным методом Максама-Гилберта.

Полученную таким образом рекомбинантную плазмиду pFP (10 мкг) гидролизуют смесью рестриктаз PstI и Hind III (20 ед и 30 ед соответственно) в 60 мкл буфера R, после чего выделяют векторный фрагмент, как описано выше, и лигируют его в течение 3 ч при 15^оС в 50 мкл буфера L с PstI-Hind III-фрагментом, выделенным из гидролизата плазмиды pLT 1, содержащим С-концевую часть гена лимфотоксина. Пятую часть лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli HB 101, как это описано выше. Скрининг трансформантов проводят путем анализа ДНК, выделенной из отдельных клонов, с помощью рестриктаз Hae III, MspI, PstI, EcoRI и Hind III.

10 мкг полученной таким образом плазмиды pFPZ гидролизуют в 100 мкл буфера R, содержащего 100 мМ NaCl, рестриктазой EcoRI (20 ед.) в течение 1 ч при 37^оС. Реакцию останавливают двукратной экстракцией смесью фен - хлроформ (1:1), ДНК высаживают этанолом, переосаждают растворяют в 100 мкл буфера и инкубируют 1 ч при 10^оС с 20 ед ДНК полимеразы l E.coli (фрагмент Кленова) в присутствии четырех dNTP (0,05 мМ каждого). После депротеинизации, как описано выше, ДНК обрабатывают в 150 мкл буфера R 30 ед эндонуклеазы Hind III в течение 1,5 ч при 37^оС и электрофорезом в 1%-ном агарозном геле выделяют фрагмент ДНК величиной около 700 п.о. 0,2 мкг этого фрагмента лигируют с 0,8 мкг векторного фрагмента ДНК, полученного последовательной обработкой ДНК плазмиды pDSpuI рестриктазой BamI, затем фрагментом Кленова ДНК полимеразы I E.coli в присутствии четырех dNTPS и, наконец, эндонуклеазой Hind III, как описано в предыдущем опыте, и очищенного электрофорезом в агарозном геле, в 20 мкл буфере в присутствии 100 ед Т4 ДНК лигазы в течение 10 ч при 18^оС. Полученной лигазной смесью (десятой частью) трансформируют компетентные клетки E.coli SG 20050. Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл) и хлорамфеникол (25 мкг/мл). Из клонов, выросших на среде с ампициллином и хлорамфениколом гибридизацией с олигонуклеотидами, соответствующими синтетической и природной частями гена ЛТ, отбирают клоны, содержащий плазмиду pLT 16, структуру которой подтверждают рестриктным анализом с помощью эндонуклеаз Hae III и Msp I, а также определением нуклеотидной последовательности от EcoRI-сайта в направлении транскрипции гена лимфотоксина.

П р и м е р 4. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК pLT 9.

Для приготовления вектора ДНК плазмиды pTNF 33D (10 мкг) обрабатывают в 70 мкл буфера R рестриктазой XhoI (20 ед) в течение 1 ч при 37^оС. Реакционную смесь охлаждают до 10^оС, прибавляют четыре дезоксинуклеозид-5' -трифосфата до концентрации 50 мМ и 10 ед ДНК полимеразы II E. coli (фрагмент Кленова), инкубируют 1 ч при 10^оС. Реакцию останавливают добавлением ЭДТА до концентрации 25 мМ. Смесь депротеинизируют двукратной фенольной экстракцией, ДНК высаживают этанолом, промывают 70%-ным этанолом. Высушивают, растворяют в 50 мкл буфера R и обрабатывают 15 ед эндонуклеазы Hind III 2 ч при 37^оС. Векторный фрагмент величиной 3,4 т.п.о. выделяют электрофорезом в 1% LMP-агарозном геле.

Затем обрабатывают 90 мкг ДНК плазмиды pLT16 в 500 мкл буфера R рестрикционной эндонуклеазой EcoRI (100 ед) в течение 1,5 ч при 37^оС. После этого прибавляют 100 мкл буфера, содержащего 66 мМ трис-HCl, рН 8,0; 77 мМ NaCl, 5 мМ MgCl₂ и 10 мМ дитиотрейтола, и 50 ед. экзонуклеазы III E.coli. Отбирают аликвоты по 300 мкл через 5,7 и 9 мин и реакцию останавливают прибавлением 35 мкл 100 мМ раствора спермина; смесь выдерживают 15 мин при 0^оС, центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин. Осадок промывают 80%-ным этанолом, содержащим 0,3 М ацетата натрия и 10 мМ ацетата магния, снова центрифугируют. Осадок растворяют в 300 мкл буфера, содержащего 50 мМ ацетата натрия, рН 5,0; 30 мМ NaCl и 1 мМ ZnSO₄, прибавляют 40 ед нуклеазы из золотистой фасоли и смесь инкубируют 30 мин при 30^оС. Реакцию останавливают осаждением ДНК спермином. Осадок промывают этанолом, высушивают, растворяют в 300 мкл буфера R и обрабатывают 80 ед рестриктазы Hind III в течение 4 ч при 37^оС, после чего фрагменты ДНК нужного размера (около 600-650 п.о.), содержащие большую часть гена лимфотоксина, выделяют при помощи электрофореза в 1%-ном геле легкоплавкой агарозы.

0,2 мкг полученного таким образом фрагмента ДНК лигируют в 25 мкл буфера L с 1 мкл векторной ДНК, полученной, как описано выше, из плазмиды pTNF 33 D, с помощью 50 ед Т4 ДНК-лигазы в течение 6 ч при 15^оС. Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli. Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампициллин (100 мкг/мл). Скрининг рекомбинантов проводят, анализируя цитотоксическую активность клеточных лизатов, как описано в примере 6. ДНК одного из клонов с высокой цитотоксической активностью лизата выделяют и анализируют рестрикционным анализом с помощью эндонуклеаз Hae III и MspI определением нуклеотидной последовательности регуляторной области и структурного гена. Рекомбинантная ДНК pLT 9 кодирует биосинтез полипептида со свойствами лимфотоксина человека.

П р и м е р 5. Получение штамма-продуцента полипептида со свойствами лимфотоксина человека.

Плазмидой pLT 9 трансформируют компетентные клетки E.coli SG 20050 по методу, описанному в примере 2, и получают штамм - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека.

Клетки E. coli SG 20050/pLT 9 выращивают при 37^оС в 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке при скорости вращения 190 об/мин, отбирают пробу 2 мл, клетки центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин, затем суспендируют в 1 мл буфера, содержащего 25 мМ трис-HCl, рН 8,0; 0,5 мМ фенилметилсульфонилфторида и 5 мг/мл лизоцима, и инкубируют 30 мин при 25^оС. Для вскрытия клеток смесь замораживают в течение 10 мин при -70^оС, а затем оттаивают во льду; эту операцию повторяют трижды, после чего определяют содержание лимфотоксина в растворе измерением его биологической активности.

Биологическую активность ЛТ определяют на культуре трансформированных мышиных фиброобластов линии L-929. С этой целью монослойную культуру клеток выращивают в СО₂-термостате в 96-луночных пластинах для культур клеток в среде DMEM, содержащей 10%-ную сыворотку теленка. Для определения биологической активности культуральную среду заменяют на свежую среду DMEM, содержащую 1%-ную сыворотку теленка, актиномицин D (1 мгк/мл) и клеточный лизат в двукратных серийных разбавлениях (примерно соответствующих концентрации лимфотоксина от 1 мкг/мл до 10^-5 мкг/мл). Пластины снова инкубируют в течение 16-20 ч в СО₂-термостате, затем клетки прокрашивают трипановым синим и подсчитывают количество окрашенных (нежизнеспособных) и неокрашенных (живых) клеток. За 1 единицу активности принимают количество лимфотоксина, вызывающее гибель 50% трансформированных клеток.

Таким образом, группа изобретений позволяет получать полипептид со свойствами лимфотоксина человека, причем уровень биосинтеза полипептида составляют 4 x 10⁵ ед/мл культуры клеток, что составляет около 15% суммарного клеточного белка E. coli при упрощенной технологии его получения за счет исключения стадии индукции биосинтеза белка.

Изобретение относится к генетической инженерии и биотехнологии, позволяет получать микробиологическим синтезом полипептид со свойствами лимфотоксина (ЛТ) человека и упростить технологию его получения. Цель изобретения состоит в увеличении уровня биосинтеза лимфотоксина. Поставленная цель достигается с помощью рекомбинантной плазмидной ДНК pLT 16, содержащей полусинтетический ген ЛТ и являющейся источником C-концевого фрагмента гена, использованного для конструирования плазмиды pLT 9. Рекомбинантная плазмида pLT 16 состоит из Hind III - sau 3AI-фрагмента ДНК плазмиды pDSpuI содержащего промотор гена белка оболочки бактериофага M13, ген β -лактамазы, ген хлорамфениколацетилтрансферазы и терминатор транскрипции фага l (3,49 т.п.о.); Hind III - EcoRI-фрагмента плазмиды pFPZ, содержащего полусинтетический ген лимфотоксина человека, а также рекомбинантной плазмиды pLT 9, кодирующей полипептид зрелого лимфотоксина человека, в котором 10 N-концевых аминокислотных остатков замещены остатком Val, и состоящей из Hind III - Kpn-фрагмента ДНК плазмиды p6Ф23, содержащего тандем промоторов A2 и A3 ранней области бактериофага T7, ген b -лактамазы и терминатор транскрипции фага l (3,4 т. п.о.);Kpn I - Hind III-фрагмента, содержащего синтетический участок инициации трансляции и полусинтетический ген измененного лимфотоксина человека. Штамм E.coli SG 20050 / pLT 9 обеспечивает уровень биосинтеза полипептида до 4×10⁵ культуры клеток. 3 с.п.ф-лы.

1. Рекомбинантная плазмидная ДНК pLT 9, кодирующая полипептид со свойствами лимфотоксина человека, с мол.м. 2,64 мДа и размером 4,06 т.п.о., содержащая
Hind III - Kpn I - фрагмент ДНК плазмиды p 6А23 с тандемом промоторов A2 и A3 ранней области бактериофага T7, геном β-лактамазы и терминатором транскрипции фага лямбда размером 3, 4 т.п.о.;
Kpn I - Hind III - фрагмент с синтетическим сайтом инициации трансляции и полусинтетическим геном лимфотоксина человека размером 0,64 т.п.о.;
генетический маркер - ген β-лактамазы, детерминирующий устойчивость клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам;
уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от сайта Kpn I : Sal I 656 нуклеотидов вправо, Hind III 668 нуклеотидов вправо, Pvu II 816 нуклеотидов вправо, NcoI 1229 нуклеотидов вправо;
аминокислотную последовательность, в которой первые десять аминокислот лимфотоксина человека заменены остатком Val. 2. Рекомбинантная плазмидная ДНК pLT 16, используемая для конструирования ДНК pLT 9, мол.м. 2,70 МДа и размером 4,16 т.п.о., содержащая
Hind III - Sa и 3 Al - фрагмент ДНК плазмиды pDSpvI с промотором гена белка оболочки бактериофага M 13, геном β-лактамазы, геном хлорамфениколацетилтрансферазы и терминатором транскрипции фага лямбда размером 3,49 т.п. о.;
EcoRI - Hind III - фрагмент плазмиды pFPZ с полусинтетическим геном лимфотоксина человека размером 0,68 т.п.о.;
аминокислотную последовательность зрелого лимфотоксина человека;
генетические маркеры гена β - лактамазы и хлорамфениколацетилтрансферазы, детерминирующие устойчивость клеток E.colI к пенициллиновым антибиотикам и хлорамфениколу;
уникальные сайты узнавания рестикционными эндонуклеазами, расположенными на следующих расстояниях от сайта SmaI : SalI 646 нуклеотидов вправо, Hind III 658 нуклеотидов вправо. 3. Штамм бактерий Escherichia coli ВКПМ В-4391 - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека.