инфекционные и опухолевые заболевания, ревматизм, синдром приобретенного иммунодефицита (СПИД) и др. Комбинированное применение в медицинских целях тимозина m с другими препаратами, например с аспирином, перспективно в иммунотерапии рака легких. Препарат аспирин-тимозин ОН предотвращает заражение вирусом СПИД. Наиболее близким техническим решением к предлагаемому является плазмид- ная ДНК рТН пп / gal, кодирующая синтез пептида со свойствами тимозина а человека 1.
Известная плазмида обладает рядом недостатков, к числу которых относится низкий уровень экспрессии гибридного белка (менее 1 %), необходимость проведения индукции биосинтеза белка, что усложняет технологию культивироавания клеток бактерий, гибридный белок аналога содержит 23 остатка метионинз. что делает процесс выделения целевого продукта трудоемким.
Целью изобретения является повышение уроркя синтеза полипептида со свойствами тимозина п человека.
Дня этого сконструирована рекомби- нэтнзя плэзмида рТНУ12, являющаяся промежуточной для конструирования рекомбинантной плэзмиды рТНУ314, кодирующей конститутивный синтез гибридного белка, от которого пептид со свойствами тимозина т человека отщепляют гидролизом бромцианом. Получен штамм E.coli SG 20050/рТНУ314. обеспечивающий высокий vposenb экспрессии гибридного белка - фактор некроза опухолей - тимозин он, из которого получают 8-10 мкг тимозина а на 1 мл клеточной суспензии при плотности клеток 10 кл./мл.
Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУ314, кодирующая химерный белок - фактор некроза опухолей - тимозин а. характеризуется мол.м. 2.57 гИд (3.98 т.п.о.) и ссстоит из:
Pstl-Sau3AI - Фрагмента ДНК плазмиды pTNF314 Д. содержащего тандем промоторов транскрипции А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, полусинтетический ген Фактора некроза опухолей человека с синтетическим участком инициации трансляции и часть гена/Ч-лактамазы (1.48 т.по.); Clal/Pstl - фоа1мента| ДНК плазмиды рТНУ12, содержащего синтетический ген. кодирующий тимусный пептид тимозин 7i, ген хлорамфениколацетилтрансферазы. терминатор транскрипции фага Я и часть гена/ -лактамээы (2 49 т.п.о): Sau3A /Clal - синтетического линкера, соединяющего в единой рямке считывания гены фактора некроза опухолей и тимозина zi(15n.o.).
Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУ314 в качестве генетических маркеров
содержит гены /3-лактэмазы и хлорамфениколацетилтрансферазы, определяющие устойчивость трансформированных плазми- дой рТНУ314 клеток E.coli к хлорамфенико- лу и пенициллиновым антибиотикам, а также уникальные сайты рестрикции. расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта Kpnl: BstEII - 405 нуклео- тидов; Bglll - 492 нуклеотида; Hindlll - 586 нуклеотидов. Pstl - 3779 нуклеотидов.
Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУ12, являющаяся промежуточным продуктом при конструировании рекомбинантной плазмидной ДНК рТНУ314, характеризуется мол.м. 2.58 Мд (4,02 т.п.о.)
и состоит из:
Hlndlll/Clal - фрагмента ДНК плазмиды pCPG2, содержащего тандем промоторов транскрипции А2 и A3 ранней области бак- териофага Т7, синтетический участок инициации трансляции, гены / -лактамазы и хлорамфениколацетилтрансферазы и терминатор транскрипции фага А (2,49 т.п.о.): Clal/Hindlll - фрагмента, содержащего синтетический ген, кодирующий тимусный пептид тимозин d (0,1 т.п.о.).
Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУ12 в качестве генетических маркеров содержит гены / -лактамазы и хлорамфени- колацетилтрэнсфереэы, определяющие устойчивость трансформированных плэзми- дой рТНУ12 клеток E.coli к пенициллиновым антибиотикам и хлорамфениколу, а также уникальные сайты рестрикции, расположенные на следующих расстояниях вправо от
сайта BamHI: Clal - 24 нуклеотида; Bglll - 75 нуклеотидов; Hindlll - 118 нуклеотидов: Ncol - 729 нуклеотидов: Pst - 2573 нуклеотида
Для получения искусственного гена, кодирующего тимозин а человека синтезируют фосфорамидитным твердофазным методом восемь олигодезоксирибонуклеотидов величиной от 21 до 29 нуклеотидных звеньев. Лигазные сшивки проводят в два этапа.
Сегмент А:
IГ III AATTCATCtA TATGAGCSATCCTCCTC ACACrrCTTCTCAAATCACC АССА
(ГТАССТАТАСТСТСТАССАаАСЛТСТСТаЛАСАЛСМГГТТАСТССТСЛГГгеТ
чt n f
Сегмент В:
tт Г УИ
СТАААСАТСТТАЛАСААААСАААСАОСГКТССАОСААССТСААААСТА
V.AATTTCI 11ILI 11CTCCAACACCTXXTTCGACTTTTCATTOCA
tV vni
На первом этапе проводят две четырех- комлонентные сшивки, причем все олиго- нуклеотиды перед сшивкой фосфорилируют при помощи АТР и Т4 полинуклеотидкина- зы, за исключением 5-концевого олигонук- еотида (I) из сегмента А и олигонуклеотида III из сегмента В. На втором этапе сшивают Т4 ДНК лигазой1 сегменты А+В, которые предварительно очищают электрофо- резом в 15%-ном ПААГ, содержащем 7 М мочевину. Получившуюся в результате 101- звенную двухцепочечную ДНК очищают электрофорезом в 8%-ом ПААГ.
После этого искусственный ген тимози- на Gfi человека клонируют в плазмиде pGEM4. Для этого ДНК плазмиды pGEM4 начала расщепляют рестриктазами EcoRI и Hlndlll, затем полученный вектор лигируют синтетической ДНК. После трансформации лигазной смесью компетентных клеток E.coll HB101 скрининг нужных клонов проводят гибридизацией колоний in situ с ( Р)- меченнымиолигонуклеотидами(1)и(VIII). Из клонов, гибридизирующихся с обоими раиоактивными зондами, выделяют плаз- мидную ДНК рТНУ1-4, анализируют ее с помощью рестриктаз Haelll и Mspl и подтверждают структуру вставки определением нуклеотидной последовательности модифицированным методом Максама- Гилберта.
Полученная таким образом рекомби- антная плазмидная ДНК р Т НУ 1-4 содержит искуственный ген тимозина fli. который может транскрибироваться SP-6 РНК-полиме- разой, и может быть использована для препаративной наработки РНК для бесклеточной трансляции с использованием лизэ- тов ретикулоцитов кролика или экстрактов из проростков пшеницы.
После этого синтетический ген тимозина сп реклонируют по сайтам Clal и Hindlll в плазмиду pCPG2. В результате получают новую рекомбинантную плазмиду рТНУ12, являющуюся промежуточной для конструирования целевой плазмиды рТНУ314, соержащую ген тимозина п, которому предшествует последовательность сайта инициации трансляции (последовательность Шайн Дальгарно), причем транскрипция тимозин а - специфической РНК обеспечивается тандемом сильных промоторов А2 и A3 бактериофага Т7. Таким образом, плазмида рТНУ12 контролирует прямую экспрессию гена тимозина ai и может быть использована для бесклеточного биосинтеза пептида с помощью сопряженной прокариотической системы транскрипции-трансляции.
Для дальнейшего конструирован-. используют плазмиду pTHNF3l ЛД, является производной рекомбинл: ной плазмиды pTNF311 Дс неизменной с г.о- мощью сайт-направленного тумгзгенезз С- концевой частью гена фактора мекргла опухолей человека. В результате тлкого му- тагенеза ILeiss заменен на остаток Leu, а в ген фактора некроза опухолей введен уни- кальный сайт рестриктазы BamHl. ДНК плэзмиды pTNF314 Д подвергают гг мест- ному гидролизу рестриктазами BamHl и Pstl и выделяют векторный фрагмент
ДНК плазмиды рТНУ12 гидролизуют эн- донуклеазами Clal и Pstl, после чего электрофорезом в 5%-ном ПААГ выделяют фрагмент величиной 2,5 т.п.о., содержащий структурный ген тимозина ai. После этого вектор лигирует с Clal - Pstl - фрагментом плазмиды рТНУ14 в присутствии синтетического дуплекса:
GATCATTGCCCTGAT(IX)
TAACGGGACTAGC(X)
Часть лигазной смеси используют для
трансформации компетентных клеток Е.со 1
НВ101. Трэнсформанты высевают на агэризованную среду, содержащую ампици лин
и хлорэмфеникол (по 50 мкг/мл) и проводят
скрининг гибридизацией колоний с P-ve fj
ным олигонуклеотидом GATCATTGCCCTGAT.
Из гибридизующихся клонов выделяют
плазмидчую ДНК рТНУ314 и анализ; .ют
ее с помощью рестриктаз Haelii и Мър;
Для получени штамма - продуцента
пептида с биологической акт ИЕНССТЬЮ тимозина d человека плазмидной рТНУ31ч
трансформируют компетентные клетки
E.coli SG20050.
Полученный штамм E.coli SG20050/ /рТНУ314 характеризуется следующими признаками.
Морфологические признаки.
Клетки мелкие, утолщенной палсчко- видной формы, грамотрицательные. неспо- роносные.
Культуральные признаки.
Клетки хорошо растут на простых питательных средах. При росте на агаре Диф- ко - колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блестящие серые, край ровный. При росте в жидких средйх(на минимальней среде с клюкозой или LB-бульоне) образуют интенсивную ровную муть.
Физико-биологические признаки. Клетки растут при температуре от 4 до 40°С при оптимуме рН от 6,8 до 7.0. В качестве источника азота используют как минеральные соли в аммонийной форме, так и органические соединения в виде пептона,
триптона,дро ж жево г с экстракта а «и окислот и т.д. В качестве источника ул-рода используют аминокислоты, глицерин углеводы.
Устойчивость к антибиотикам
Клетки проявляют устойчивость к ампи- циллину (до 300 мкг/мл) и хлорзмфениколу (до 500 мкг/мл). обусловленную наличием ппазмиды. а также к тетрациклину (до 25 мкг/мл). благодаря наличию трзнспозо- на.
Штамм E.coll SG 20050/рТНУ314 обуславливает конститутивный синтез гибридного полипептида - фактор некроза опухолей - тимозин а. от которого пептид со свойствами тимозина а- человека может бит-, отщеплен действием бромциана. при- UPM уровень биосинтеза гибридного белка (.оставляет свыше 20% тотального клеточного белка бактерий, что соот ветствует 8 10 мм гептида на 1 мл клеточной суспензии.
Штамм депонирован во Всесоюзной коллекции промышленных микросрганиз- мое ВНИИгенгтнка под номером ВК ПМ В- 5056.
П р и м е р 1 Химике -фе оме ч т эти р. ч и и синтез не л г i синего структурное гена
г имо/и -:ч - ьекз
Сич еэ О и сну леотидсв выг. твеоцс эзным фосфидэмидитным методом
. ..:. ИНТР/-JT OP9 С Н Р 11;И 3 -Ч : М Р.ПИ:п-дис
о
R nf НИИ ОТ
: гс - ощькз защищенных о ос Фа м ,,: ит о в - с- ситритн.,- зцил-2 -дезоксинуо-:-о/ид-3 -С (мет оксид и- изопрогг. гзмино)-Фссфито8. л к т, в и рова н- иыл тетрззочом Си г-: тез проводит е масштабе 0.5-07 мкмоль. i-спг.п.ьзуя в каче:тп.е иоситега пористое стекп (размер пор 500 А. разыерчастиц4Q-8C мкм1 i которому через 3-суцинэтчую связь присоединяют первое нуклеоз дноезве о (нагрузка 20 - J. О чкмсгь/г) Испечь;уют ;инте 1 ческий г g котором после реакции конденсации г гс зодят промыьку с - ПЬ Смесь 0 тетр«( ид- г Фуран - пиридин - вода (53:2) После окончания синтеза защитные группы удаляют последовательной обработкой тиофено- лнтом т риэт и л at-1 мо HI , а и концентрированным аммиаком При этом происходит отделение олигонуклротидэ от носителя 5- Лиметокситритильную группу удаляют кислотной обработкой v олигонуклеотид очищают электрофорезом в 20%-ном ПААГ. содержащем 7М мочевину Выход 1-5 о.е
Смесь 250 пмоль олнгонуклеотидя fl) и 200 пмоль каждого фосфорилироеэнного олигочуклео ида (Hi и (14) и 250 пмоль фос- t- Орилированнсго олигонуклеотида (f) на
гревают 10 мим при 9П°С в 100 мкл буфера. содерхз1це о 20 мМ т рис HCI, рН 7.5. Н) мМ MgCli затем мрдте но охлаждают до 15°С прибавлак.ттf Al P до юмцритрации 0.2 мМ.
5 дигиотреит до KOHUf нтра1дии 10 мМ и 100 ед. Т4 ДНК-лигазы Смесь инкубируют 6 ч при 15°С. затем депротеинизируют двухкратной фенольной экстракцией. ДНК высаживают этанолом и продукты сшивки выделяют при
10 помощи электрофореза в 15%-ном ПААГ, содержащем 7М мочевину, Очищенный продукт сшивки элюируют из геля электроэлю- цией на бумагу DE-81. которую промывают несколько раз ТЕ-буфером (10 мМ трис-НО;
15 рН 80; 0,5 мМ EDTA) и этанолом. Нуклео- тидный материал элюируют при помощи 1 5 М раствора NaCI в ТЕ-буфере и обессоливают на колонке с сефэдексом G-50 Выход сегмента А 140 пмоль
20Аналогичным образом получают сегмент В. Виход 180 пмоль.
Далее г.ч ивают по 50 пмоль каждого сегмента А. и В Р 20 мкл буфера, содержащего 20 мМ триг-HCI, пН 7 5 Ю мМ .
25 0.2 мГ/гАТ0. 1C мМ дитиотреит (буфер С) и 50 ед Т4 ЛмК-лигазы. в течение 4 ч при Ппс,:, т cujHBiM вь:деГ1 |Т з.тектрсфо- е 8 . ном ПААГ кэ описано Вчход
3 J ПМОЛЬ СТРУКТУРУ ГПОМРжу ОЧНЫХ И КО30 (-.ечны продуктов лигазных реакций под- т в е о ж д а -: т .J 3 п и : о м н к л е о т и д н о и п о с л д о ь -, т - т t- о с т i .
г. и - f р 2 Коьгтруировзиие рекомби- нэнтной г pThy1-4
35Кл- -тк,- акгеоий f. coli, JM101. содержащие .ч-.лгг иднуцэ ДНК pGEf-/4, выращивают при е LP-бульоне, содерхашем 100 м к г af- пицил тина, дз стационапной Ф азы Затем тетки отделяют известной
40 проаед-. ,си с модификациями, заключающимися в -ом что к супернатанту. получсн- ному посте подкисления ацетатом натрия. прибаег-ют ГНКззу А до концентрации 10 мкг/м: смесь инкубируют 20 мин при
d5 37°C. экстрагируют дважды смесью фенол- хлороФорм (1:1) и ДНК выезживают этанолом. Осадок растворяют в ТЕ-буфере, содержащем 1 М NaCI. прибавляют поли- этиленгликоль(ПЭГ 6000) до концентрации
50 1.5%, выдерживают 1 ч при 0°С. центрифугирую7 10 мин при 10000 об/мин, а осадок промь:вают 70%-ным этэнолом. высушивают и растворяют в ТЕ-буфере Выход плазмидной ДНК определяют спектро55 фотометрически при 260 нм с использованием коэффициента экстинкции 20 о.е./мг.
Аналогичным образом выделяют ДНК плазмиды PTNF314 Д, содержащую мутан- тный ген фактора некроза опухолей человека. а также новые рекомби1 а тнме плаз- мидные ДНК рТНУГ A. pTHV12 и р7НУ314.
Полученный пре.паоят плаз . идной ДНК pGEM4 используют для конструирования плазмиды рТНУ1-4. которое проводят сле- дующим образом
5 мкг ДНК плазмиды pGEM-1 инкубиру- ют с эндонуклеазами рестрикции EcoR и HindMI (20 ед. каждой) в 100 мкл буфера В (20 мМ трис-HCI: рН 7.5. 50 мМ №Ci: 10 мМ MgCl2: 5 мМ меркаптоэтанол) 1 ч при 37°С. После инкубации реакцию останавливают двухкратной экстракцией смесью фенол- хлороформ (1:1). Анализ полноты гидролиза и выделение векторного EcoRI/Hindlll - фрагмента проводят электрофорезом в 1%- ном агарозном геле. Далее 1 мкг векторной ДНК соединяют с 0.2 мкг синтетического двухцепочечного фрагмента из примера 1 с помощью 30 ед. Т4 ДНК-лигазы в 50 мкл буфера С в течение 6 с при 15°С.
Десятую часть реакционной смеси используют для трансформации клеток E.coli JM101. для чего клетки высевают на агар. содержащий среду М9, 0.2% глюкозы и 2 мкг/мл тиамина. Единичную колонию вносят в 50 мл питательного бульона и выращивают при 37°С до мутности 0.3-0.5 Затем клетки охлаждают, осаждают центрифугированием (10 мин, 5000об/мин), промывают раствором 10 мМ MgCI/. центрифугируют, суспендируют в 20 мл 0.1 М растеорз CaCI: и выдерживают 30 мин при 0°С. После центрифугирования клетки ресуспендируют в 3 мл 0,1 М CaCI и через 3 ч используют дтя трансформации. С этой целью 5 мкл лигаз- ной смеси смешивают с 50 мкл 0.05 м CaCI. затем прибавляют 150 мкл суспензии ком- петентных клеток, выдерживают 30 мин при 0°С, затем 2 мин при 42°С и снова 10 мин при 0°С, после чего прибавляют 1 А мл LB- бульона, инкубируют 1 ч при 37°С и аликво- ты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим 100 мкг/мл ампициллина. Полученные колонии переносят на параллельные нитроцеллюлозные фильтры и анализируют на содержание гена тимозина а гибридизацией колоний in situ с ( Р)-ме- ченными олигонуклеотидэми ()и (VIII). Колонии, дающие положительную гибридизацию с обеими пробами, отбирают и выделенную из них плазмидную ДНК анализируют при помощи эндонуклеаз HaeMI и Mspl. Окончательно структуру рекомбинантной ДНКрТНУ1-4 подтверждают определением части ее нуклеотидной последовательности между сайтами EcoRI и Hindlll.
П р и м е р 3. Конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК рТНУ12.
ДНК млр м:«дь| pC°G2 (5 мкг) гидролизу- ют сор - естно зндгнуклг.аззми рестрикции (по 1C1 ед каждой) ГЫ и Hindlll в 100 МУЛ буфера R Р Т.-.4ЛН.- 1 5 ч гти Поте 5 инкуСк цин смесь 3 п ряги ру ют д.ражды смесью Ф°нол хлорофос - (1:1} и векториуй Фрагмент величиной 3.94 т.п.о. вы до л г электроtооезом в 1%-ном агарозном геле Затем 30 мкг ДНК плазмиды рТНУ1-4 гид0 ролизуют в TON же буфере с помощью смеси 60 ед. каждой из рестриктаз Clal и r-lindlll. после чего выделяют электрофорезом в 8%- ном ПААГ фрагмент величиной 93 и.о., содержащий синтетический ген тимозинд :.
5 Послезтого пигип ютО.15 мкг этого Фрзгментэ с 0.6 мкг Clal/HindIM фрагмента пязмиллы pCPG2 в 25 мкл буфеоа С в присутствии 50 ед. Т4 ДНК-лигазы. Черед 3 ч при 15еС 5 мкл лигазной смеси используют для трансфор0 мации компетентных клеток E. HB101. Скринпнг клпмпв пповод-т гибр1 дизацией хлорлмфенык олустойчирых. ний с ( PJ-MPucHMHM слигонучлеотндом нч присутствие синтетическ о о { рагмент,-з
5 гена тимог.ина а Из гигЗридизируощихся клонов выделт т ДНК, анализируют се с помощью рес р. ктаэ Haeil1 и Wspl и под- тверхдаю структуру -гпреде/;ен|-.--и нукгеп- тидной последоеательиос и мог.ифициг::;0 ванным методом Мэксама-Г1.бс о-а.
П р ; .1 р р 4 KoHCTpVnpOi;..0 Г Омби- Н1Н и /i; -..1. Л Н г: г ТН Y3 .
ДН-: г-лчзчидп г (10 гих ) сбса- - гы-.з-: т г 70 мкл буфера Б рЈ:г.трнкта.-.-.-,5 Clsl и Ргл (по 20 ед.) в течение 1 м Грп . фрагмент вели шиой 2.9 т.п о. вмдел ют электроФооезС М з 1%-ном геле ни коплап- кой а га розы. 15 мкг ДНК плазмиды pTHNF314 Д гигролизуют рестриктазами
0 ВатН и Pstl (по 20 ед.) в течение 1.5 ч при 37°С и выделяют фрагмент величиной 1.48 т.п.о.. содержаи;ий промоторк танс- крипции и мутзнтнь й ГРН фактора ieкpcзa опухолей человека. 0.2 гэлучен5 ного фрагмента ДНК лигируют Е 25 мкл буфера С с 0.5 мкг векторной ДНК. полученной из плазмиды рТНУ12 с олигонуклеотидами (IX) и (X) (по 0,2 мкг каждого) с помощью 50 ед. Т4 ДНК-лигаэы в течение 15 ч при
0 15°С. Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компетентных клеток Е соП. Трансформанты высевают на чашки с LB-агаром, содержащим ампицил- л и н (100 м г. г / м л) и х л о р з м ф е н и к о л
5 (50 vr/мл). Скрннинг рексмбинантоа проводят гибридизацией колоний с ( Р) мечен- ным ол игонух-еотидом (Х). Из гибридизующихся клонов выделяют плазмидную ДНК рТН У314, которую анализнруют рестрикционным анализом с помощью эндонуклеаз Haelll и Mspl и определением нуклеотидной последовательности области стыковки структурных генов фактора некроза опухолей и тимозина си.
П р и м е р 5. Получение штамма-продуцента полипептида со свойствами тимозина а человека.
Плазмидой рТНУ314 трансформируют компетентные клетки E.coll SG 20050 по методу примера 2 и получают штамм-продуцент полипептида со свойствами тимозина а человека.
Примерб. Определение продуктивности штамма E.coll - продуцента полипептида со свойствами тимозина а человека.
Клетки E.coll SG 20050/pThy314 выращивают при 37°С в 1 л LB-бульона. содержащего ампициллин и хлорамфеникол (по 30 мкг/мл) в течение 20 ч на качалке при скорости вращения 190 об/мин. Клетки центрифугируют 10 мин при 6000 об/мин, затем суспендируют в 15 мл буфера, содержащего 10% сахарозы, 50 мМ трис-HCI. рН 8.0, 0.2 мМ NaCI и 0,1 мМ фенилметилсульфо- нилфторид. и озвучивают пульсами по 30 с. при частоте 22000 Гц в течение 10 мин при 4°С. Полученный лизат центрифугируют в течение 15 мин при 8000 об/мин. Осадок суспендируют в 10 мл.7 М гуанидинхлорида при 4°С в течение б ч. супернатант после центрифугирования разбавляют 10 обьема- ми холодной воды, выпавший осадок отделяют центрифугированием. Осадок (по данным SDS-электрофореза в 13%-ном ПА- АГ 90%-ной чистоты химерный белок - фактор некроза опухолей - тимозин 0,7 г влажной массы) суспендируют в 10 мл 0,1 % BrCN в 80%-ной муравьиной кислоте, и смесь перемешивают 16 ч при 20°С. после чего растворитель удаляют в вакууме при 30°С. Остаток суспендируют в 2 мл 7 М мо- чевчны, доводят рН раствора этаноламином до 5.0 и встряхивают 2 чпри20°С. после чего разбавляют водой до объема 50 мл и выдерживают при перемешивании 12 ч при 4°С. Осадок удаляют центрифугированием (30 мин при 15000 об/мчн). раствор наносят на колонку (1,2x30 см) с DEAE-целлюлозой DE-52, уравновешенной 20 мМ ТЕАВ (рН 7,9). Для элюции используют градиент концентрации NaCI в том же буфере. Дезаце- тил-тимозин «1 эпюируется с колонки при концентрации NaCI 0,2-0.3 М.
Фракции, содержащие пептид. объединяют, концентрируют лиофилизацией и хро- матографируют в 10 мМ аммоний-бикар- бонатном буфере на колонке (1x50 см) с Uluogel AcA 202. Фракции, содержащие ти0
5
0
5
0
5
0
5
0
5
мозин ai, объединяют и лиофилиэируют. Получают 8.5 мг пептида, частота которого 95%.
Таким образом, предлагаемый способ позволяет получать пептид со свойствами тимозина а человека с уровнем биосинтеза 8-10 мкг/мл культуры клеток. При этом технология его получения значительно упрощается за счет исключения стадии индукции биосинтеза белка.
Формула изобретения
1. Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУ314, кодирующая полипептид со свойствами тимозина а человека, размером 3,98 т.п.о. и мол.м. 2,57 Мд, содержащая:
-Pstl - Sau3AI - фрагмент ДНК плэзмиды PTNF314 Д размером 1,48 т.п.о., с полусинтетическим геном фактора некроза опухолей человека и синтетическим участком инициации трансляции:
-Clal-Pstl - фрагмент ДНК плазмиды рТНУ12. размером 2.49 т.по., с синтетическим геном, кодирующим полипептид со свойствами тимозина и.
-SauSAI CIal - синтетический линкер. GATCAT1GCCCTGAT TAACGGGACTAGC:
- генетические маркеры:
Ыа - ген / -лэктэмэзы;
cat - ген хлорамфениколацетилтранс- феразы;
- тандем промоторов транскрипции А2 и A3 ранней области бактериофага Т7,
- уникальные сайты рестрикции, расположение на расстоянии вправо от сайта Kpnl: BstEl - 405 нуклеотидов; Bglll - 492 нукле- отидэ; Hindlll - 586 нуклеотидов. Pst - 3779 нуклеотидов.
2. Рекомбинантная плазмидная ДНК рТНУ12 - промежуточный продукт для конструирования рекомбинантной плазмидной ДНК рТНУ314, кодирующей полипептид со свойствами тимозина о. человека, размером 4,02 т.п.о., содержащая:
- Hindlll - Gal - фрагмент ДНК плазмиды pCPG2, размером 3,92 т.п.о.;
- С1а - Hindlll - синтетический ген. кодирующий полипептид тимозин а человека, размером 0.1 т.п.о.:
- уникальные сайты рестрикции, расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта Bam HI: Clal - 24 нуклеотида: Bgl II
- 75 нуклеотидов; Hindlll - 118 нуклеотидов: Ncol - 729 нуклеотидов; Pstl - 2573 нуклеотида;
- тандем промоторов транскрипции А2 и A3 ранней области бактериофага Т7, синтетический участок инициации трансляции, терминатор транскрипции фага А;
131707078 14
- генетические маркеры:3. Штэмм бзктерии Fscherlchla coii Ыа - ген Д-лактамазы: ВКПМ В-5056 - продуцент полипептида со cat - ген хлорамфениколацетиптранс- свойствами тимозинз л чеповекл.
фераэы.
Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Целью изобретения является повышение уровня синтеза полипептида со свойствами тимозина ai человека. Получены рекомби- натная плазмида рТНУ314, кодирующая пептид со свойствами тимозинэ а человека, штамм E.coll ВКПМ В-5056, обеспечивающий синтез полипептида со свойствами тиИзобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической .инженерии. Тимозин a один из более, чем 30 пеп- тидов низкой мол.м. (1000-15000). выделяемых из вилочковой железы (тимуса), обладает мощной общей иммуностимулиру- ющей активностью. Тимозин «1 синтезируется в организме в виде предшественника, мозинэои человека, и рекомбинантнад плаз- мидная ДНК рТНУ12, являющаяся промежуточным продуктом для получения плазмиды рТНУ314. Рекомбинантная плазмида рТНУ12 содержит синтетический ген полипегпида со свойствами тимозина а человека, состоит из Hind Ill/Cla I - фрагмента ДНК плазмиды pCPG2, содержащего тандем промоторов транскрипции А2 и A3 раччей области бактериофага Т7. синтетический участок инициации трансляции, гены / -лак- тамазы и хлорэмфениколэцетилтрансферг- зы и терминатор транскрипции фага ). Clal/Htnd II - Фрагмента, содержащего сич- тетический ген. кодирующий ц:му: ый пег,- тидтимозина й человека. РексмСч-мЗг -няя плазмидная ДНК рТНУЗ 4 содержит ген полипептида со свойствами тирозина а человека, который конститутивно экспрессиру- ет в клетках E.coli в составе химернот ПСПУ.Э фактор некроза опухолей -тимозгн ;;. Штамм Escherichia coli SG20050/pTHV314 обеспечивает уровень биосинтеза тимусно- го пептида тимозина а человека до 8 - 10 мкг/мл при упрощенной технологи;. его выделения. 3 с.п. ф-лы. от которого он отщепляется и затем подвергается N-концевому ацетилированию. N- дезацетилтимозин сп обладает набором биологических активностей натипно о пептида, в частности тимозин щ стимулирует Т-клетки, индуцируя синтез интерпейкина-2 и /-интерферона, делая их эффективными против широкого ряда патологий, таких как С Ssl I и ь
| Способ получения фтористых солей | 1914 |
|
SU1980A1 |
| Способ изготовления электрических сопротивлений посредством осаждения слоя проводника на поверхности изолятора | 1921 |
|
SU19A1 |
