Рекомбинантная плазмидная ДНК pLT21, кодирующая полипептид со свойствами лимфотоксина человека, и штамм бактерий ESCHERICHIACOL - продуцент полипептида со свойствами лимфотоксина человека Советский патент 1993 года по МПК C12N15/12 C12N15/77 

Изобретение относится к биотехнологии, а частности к генетической инженерии, и представ/1яет собой сконструированную In vitro рекомбинантную плазмидную ДНК, содержащую полусмнтетический ген лиМфотоксина чело-века, промоторы ранней области бактериофяга Т7 и синтетический участок инициации трансляции, обусловливающий биосинтез полипептида с биологической активностью лимфотоксина человека, а также штамм Escherlchia coll - продуцент этого полипептида.

Лимфотоксин (ЛТ) представляет собой гликопротеин с мол. м. около 25000 Да. 8 организме человека лимфотоксин главным образом продуцируется яктипированными Т-лимфоцитами. В опытах in v.itro и in vivo было продемонстрировяно. что природный(гЛикоЭилированный) и рекомбинантный (негяикозилированный) лимфотоксин вызывает геморрагический некроз некоторых видов солидных опухолей, ггричем как и 0 случае фактора Кекрбза опухоли особенно эффективно его цитотоксическая активнбсть пррявляется на опухолях с повышенной |йалигнатностью. Как и фактор некроза опухоли лимфотоксин, являясь иммуномодулятором широкого спектра дейстаия, проявляет свою.цитотоксическую актианость .аьгсоко збирательно, воздействуя лишь на опухопевые клетки и не затрагивая здоровые, нетрансформироваиные клетки. Кроме того, следует отметить, что лимфотоксин обладает выраженным противовирусным действием по отношению к ряду ДНК- и РНК-содержа1цих вирусов. Все это делает медицинское применение лимфотоксина человека чрезвычайно перспективным.

Известен способ получения лимфотокейна человеке, основанный на культивироёанйи опухолевых линий клеток человека RPMI-I788 и АС5-ё. которые при инДукции форболовыми эфирами, бактериальными эндотоксинами и конканавалином А секретйруют лимфотоксии во .внеклеточную среду.

Недостатками этого метода являются Чрезвычайно низкий выход целевого продукта, трудности крупномасштабного культивирования клеточных линий и, как следствие, высокая стоимость препаратов ЛТ,.

Значительно более перспективным является способ получения лимфотоксина микробиологическим синтезом, который обеспечивает возможность получения целевого продукта со значительно более высоким выходом из сравнительно недорогого /сходного сырья. Использование при этом химического подхода позволяет со13Ддть оптимальные для бактериальной экспрессии варианты структурного гена, а также регуляторных элементов, контролирующих его экспрессию.

Известна рекомбинантная плазмида pLTtf р t, кодирующая полипептид со свойствами лимфотоксина человека, в которой ген ЛТ экспрессируется под контролем промотора триптофанового оперона. Сведения об уровне биосинтеза, лимфотоксииа штаммом Е.соИ. содержащий плазмиду pLTtrpt, отсутствуют.

Известна рекомбинантная плазмида pLT13tac6-8.2. кодирующая пол41пептид со свойствами лимфотоксина человека, сконструированная на основе плэзмидного вектора рКК223-3. Пяазмида pLTtac6-8.2 содержит укороченный ген, йодирующий Белок, у которого в отличие от природного белка вместо первых десяти Ы-кйицевых аминокислотных остатков имеется последовательность AspLeu. Такая конструкция 8

штамме Е.соИ JM105 при индукции изопропилтио-/ -D- галактозидом (IPTG) обеспечивает экспрессию измененного гена ЛТ, причем биологически активный белок составляет t% суммарного белка бактерий.

0 Недостатком плазмиды pLTtac6.8-2 является недостаточно высокий уровень биосинтеза ЛТ, обеспечиваемый содержащим ее штаммом-продуцентом, а также необходимость в этом случае и в случае плазмидь

S pLTtrpI осуществления нетехнологической стадии индукции биосинтеза при по. учении лимфотоксина, так как экспрессия генов ЛТ в этих конструкциях индуцибельна.

Кроме того, недостатком известных

0 плазмид является также то, что все они имеют малопригодную для генно-инженерных операций рестриктную кэрту, что значительно затрудняет дальнейшие операции по уЬовершенстеованиюплазмидных

5 конструкций с целью достижения макси- мальной экспрессии полусинтетического гена ЛТ.

Известная рекомбинантн я плазмидная ДНК pLT9, кодирующая укороченный с

0 N-конца полипептид со свойствами лимфотоксина человека, в котором 9 N-концевых аминокислот заменены остатком валина. Экспрессия гена укороченного полипептида в плазмиде р1Тб контролируется консти5 тутиаными промоторами А2-и A3 райней

области бактериофага Т и синтетическим

участком инициации трансляций. Штамм

Е.соИ SG 20050, содержащий плазмиду

pLT9, обеспечивает вьлсокий уровень пол0 ипептида со свойствами лимфотоксина человека (свыше 4 X 10 ед/мл клеточной суспензии).

По .принципу конструирования рекомбинантная плазмида pLT9, содержащая измененный ген лимфотоксина, является наиболее близким техническим решением к изобретению.

Целью изобретения является повышение выхода полипептида со свойствами

0 лимфотоксина человека.

Поставленная цель достигается с помощью новой рекомбинантной плазмиды Р-1.Т21, кодирующей конститут-ивный синтез полипептиДа со свойствами димфотоксина

5 человека, и штамма E.coli SG 20050/pLT2t, обеспечивающего уровень экспрессии ЛТ2 X 10 efi./мп клеточной суспензии при плотности клеток 10 клоток/мп.

Рекомбинантнэя плл мидная ДНК OLT21, кодирующая пЬ-Имгл-гид со свойствами лимфотоксина человека, характеризуется следующими признаками: кодирует аминокислотную последовдтепьность лимфотоксина человека, у которо го делегирован 21 М-концевоЛ аминокислотный остаток, имеет мол.м. 2,62 МДэ{4.02т.п,о.),: состоит из: Hfndlll/Kpni - фрагмента ДНК.плззми дырТМРЗ, содержащего тандем промоторов А2 и A3 ранней области 6актерйрфэ а Т7, те|5минатортранскрипции фага лямбда, ген Д-лактамаэы и ген хлорамфениколацетилтрансферазы (3,4 Т.П.О.). Kpnl/Hindtll - фрагмента, coдepжaщёt i синтетический сайт инициации трансляций и мутантный геном лимфотоксина человека (0.63 Т.П.О.). содержит: в качестве генетического маркера гём -лактамазы и ген хлорамфениколацетилтрансферазы, детерминирующие устойчивость трансформированных плазмидой pLT21 клеток Е.соИ к пенициллйноаым антибиотикам и хлорамфениколу. уникальные сайты узнавания рестрикционными эндонуклеазами. распрложеннь ми на следующих расстойииях впрйвр от сайта Kpnl: Gsul - 129 нуклеоТидоа. Salt 618 ну кл еоти До в. Н i п d 111 - 630 нукл ебтидоё, Ncol - 1181 нуклеотид. Ndel - 1955 нуклео .ТЙД08.- . . ,.., ,: ; .; ;;;,. Рекомбинантная плазмида pLT2l содержит полусинтетический мутангный гей лимфотоксина человека- Источником для ее получения была рекомбинантная плазмида pLT16. содержащая полусинтетический геи, кодирующий последовательность приройного негликозилированного лимфотоксмна человека. На фиг. ,1 изображена частичная CTpyie тура плазмиды pLT20 (нумерация аминокис лот по последовательности лимфотрксинэ)« схема.локализованного олигонуклёотид-направленного мутагенеза плазмйды ptT20; на фиг. 2 представлена структура полйпептида. крдируемого рекомбинантной лйзмй дойр1Л21.: Для получения бактериальногй штамма - продуцента полипептида с биологической активностью лимфотоксина челойека плазмидой pLT21 трансформируют хомпе тентные клетки Е.соН SG 20050. Полученный таким образом tUtaMM Е.соП SG 20050/PLT21 характеризуется еле дующими признаками. Морфологические признаки .KfletKW мелкие, утолщенной палочковидной формы грамотрицательные. неспороносныв. ; Культуральные призняки. Клетки хороши растут на простых питательных средах, При росте на агаре Дифко колонии круглые, гладкие, прижаты, мутные, блестящи серые, край ровный. При росте вжидких средах (на минимальной среде с глюкозой или LB-бульонб) образуют интенсивную ровную муть. Физико-биологические признаки. Knetки растут при температуре 4 до 40С при оптимуме рН от 6,8 до 7.0, В качестве источника азота используют как минеральные toли в аммонийной форме, так и органические, соед нения в виде пептона, триптона, , дрож)евого экстракта, аминокислот и т.д. В качестве источника углерода испопьзуют аминокислоты, глицерин, углеводы. Устойчивость к амтибиотикаМ.КлеткМ проявляют устрйчивость к ампициллину (до 300 мкг/мл) и хлорамфениколу (до 500 мкг/мл). Ьбуслоаленную наличием плазмйды. а также k тeтpa циклинy (до 30 мкг/мл) благодаря наличию Tpaffcno30Ha; Штамм Е,соН Sd 20050/pLT21 обуслойливает. конститутивный синтез полипептида (фиг. 2) со саойсгвами лимфотоксина человека на уровне2х10 ед/мл клеточной суспензии, что составляет CBbiiue 25% тотального клеточного белка бактерий и превышает ho казатели известных штаммов E.coli - продуцентов лимфотоксина. П р и м ер 1. Химический синтез рлигонуклеотидоз. Синтез олигонуклеотидов выполняют твердофазным фосфорамидитным методом на ДНК-синтезаторе System I (Beckman) с наращиванием олигонуклеотидной цепи в направлении от з-конца к 5-концу с помощью защищенных фосфамидитов -В-диметокситритилМ-ацил-2- дезоксинуклеозид-з- 0-(метоксид и из on роп иламино)-фосфитов. активированиы)тетразолом. Синтез проводят в масштабе 0.5-0,7 Мкмоль. используя в качестве носителя пористое стекло (размер пор 500 А, рязмер частиц 40-60 мхм), к которому через 3-сукцинатную связь присоединяют первое нуклеозидное звено (нагрузка 20-30 мкмоль/г). Используют известный синтетический цикл с тем лишь отличием. что после реакций конденсации проэодпт промывку смолы смесью тетрагидрофуран пиридин- вода (5:3:2), После окончания синтеза защитные груяпь удаляют последоваельной обработкой тиофенолйтом риэтиламмон я и коиц. аммиаком. При этом происходит отделение олигонуклеотиа от носителе Б-Диметокситритильную руппу удаляют кислотной обработ1 :ой и лигонуклеотид очищают электрофорезом в

0% ЛААГ, содержащем 7М мочевину. Выод 1-5 о.е.

П р и мер 2- Конструирование рекомбиаитной плазмидной ДНК pLT21.

Для приготовления вектора ДНК ллазиды рТМРЗЗД(10мкг) обрабатывают в 70 кл буфера R {2Q мМ трис-ИС1, рН 7.5.10 мМ MgCi2. 50 мМ NaGI. 5 мМ меркаптоэтанол) рестриктазой Xhol (20 ед.) в течение 1 ч при 37°С. Реакционную смесь охлаждают до 10°С. прибавляют четыре дезонкринуклеозид-5трйфосфата До концентрации 50 мкМ и 10 ед. ДИК полимеразы 1 Е.соП (фрагмент Кленова), инкубируют 1 ч при 10°С, после чего реакцию останавливают прибавлением EDTA до концентрации 25 мМ. Смесь депротеинизируют двухкратной фенольной экстракцией. ДНК высаживают этанолом. промывак т70%-ным этанолом, высушивают, растворяют в 50 мкл буфера R и обрабатывают . зндонуклеазы HIndlil 2 ч при 37°G, Векторный фрагмент величиной 3.4 т.п.о. выделяют злектрофорезом в 1 % LMP-агарозном геле4 Затем обрабатывают 90 мкг ДНК плазмиды pLTI6 в 500 мкл буфера R рестрйкционнОй зндонуклеазой EcoRI (100 ед.) в течение 1. 5ч при 37С. После этого прибавляют 100 мкл буфера, содержащего 66 мМ трис-НС1; рН 8.0, 77 мМ NaCi; 5 мМ MgCl2 и10 мМ Дитиотрейт, и 50 ед.экзонуклеазы ill Е;со11 (Slgrria). Отбирают алйквоты по 300 мкл через 5, 7 и 9 мин и реакцию останавливают прибавлением 35 мкя 100 мМ раствора спермина; смесь выдерживают 15 мин при 0°С центрифугируют 10 мин при 12000 об/мин. Осадок промывают 80%-ным этанолом, содержащим 0.3 М ацетат натрия и 10 мМ ацетат магния, снова центгрифугируют, после чего осаДок раст1аоряЮт в 300 мкл буфера, содержаще fo 50 мМ ацетат натрия, рН Б.О 30 гиМ NaCI и 1 MMZnS04, прибавляют еД. нуклеазы из золотистой фасоли и смесь инкубируют 30 мин при . Реакцию останавливают чэсаждёнием ДНК спермином как описано выше.; Осадок промывают этанолом, высушивают, растворяют в ЗОО мкл буфера R и 66рабат:ывают 80 ед. рестриктазы Hrndlll в течение 4 ч при 37°С. после чегр фрагменты ДНК нужного размера (около 600-650 п.о.), содержащие большую часть гена лимфотоксина, выделяют при помощи электрофореза в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы.

0,2 мкг полученного таким образом фрагмента ДНК лидируют в 25 мкл буфера L (20 мМ трис-НС1,- рН 7.5. 10 мМ MgCl2. 0.2 мМ гАТР, 10 мМ дитиотреит) С 1 мкг векторной ДНК. полученной, как описано выше, из плазмиды pTNF33 . с помощью :50 ед. Т4 ДНК-лигазы в течение 6 ч при 15°С.

Аликвоту реакционной смеси используют для трансформации компонентных клеток E.coli. Трансформанты высевают на чашки с LB-arapOM, содержащим ампициллин

(100мкг/мл)ихлорамфеникол. Скрининг рекомбинантов проводятс помощью гибридизации колоний 1п situ с р-меченными. олигонуклеотидами (1) и (П). Из клонов, гибридизирующихся с олигонуклеотидом (II) и

негибридизующихся с олигонуклеоитидом (I). выделяют ДНК и анализируют с помощью эндонуклеаз НаеШ и Mspl м определением

нуклеотидной последовательности регуляторной области и начала структурного гена.

Одну из полученных таким образом рекомбинантных ДНК, pLT20. используют для дальнейшего конструирования.

П р и м е рЗ. Конструирование рбкомбинантной плазмидной ДНК pLT21,

К раствору 10 мкг ДНК плазмиды pLT20 в 100 мкл буфера R прибавляют рестриктазы Kpnl и HindUl (по25 ед. каждой) и инкубируют 1 ч при 37°С. после чего фрагмент (-700 п.о.) выделяют электрофорезом в

1 %-ном геле легкоплавкой агарозы. Акало-. гичным образом гидролизуют 2 мкг репликативной Формы ДНК (РФ ДНК) фага Ml3mp10 тидролизрм той же смесью зндонуклеаз и векторный фрагмент также очиЩают электрофорезом в 1 %-ном геле легкоплавкой агарозы. Затем 0.5 мкг векторного фрагмента -лигируют с 0,1 мкг Kpnl/Hindlfi-фрагмента. полученного из плаймиды pLT20, в 20 мкл буфер L а течение 10 ч При 13°С. Одной десятой частью лйгазнрйс;меси трансформируют компетентные клетки Е.coll WK6 mutS. После трансформации клетки смешивают при с 3 мл 0,8% иВ-агара. содержащего

40 мкг/мл 5-бром-4-хлрр-р -D-галактопиранозид (X-GaO, 1 мМ изопропилтио-/ -D-raлакто-пиранозид и 200 мкл культуры Клеток Е.сбИ mutS в логарифмической фазе

роста. Смесь выливают на чашки с 1.6%

LB-arapoM и после застывания инкубируют 16ч при37°С Из фаговых клонов, образующих бесцветные бляшки, выделяют двухцеЬочную РФ ДНК и ее анализируют с помощью совместного гидролиза рестриктазаМй Kpnl и Hindfll. Для дальнейшей работы .испрльзуют рекомбииантный фаг M13LT20. содержащий нужной величины фрагмент Kpnf/Hlndlll. Для выделения одноцепочечной(+)-ДНКк 10мл 2 X LB-бульона

прибавляют 0.1 мл ночной культуры клеток Е.соП WK-6 njutS: в смесь вносят кусочек верхнего агара, содержащего индивидуальную фаговую бляшку, и инкубируют при аэрации 6 ч При 37°С. Зятем vлегки центрифугируют {12000 об/мин; 5 мин), к суперматанту прибавляют 1,4 мл растворЭ, содержащего 20% полиэтиленгликоля (ПЭГ-бООО) и 2,5 М NaCl. выдерживают 15 мин при 20°С и центрифугируют 5 мин при 12000 об/мин. Осадок растворяют в 100 мкл буфера, содержащего 20 мМ трис-HGt, рН 8.0. 1 мМ EDTA. раствортрижды экстрари руют фенолом и ДНК высаживают этано.ЛОМ- - -..:, ;

Для проведения мутагенеза 0.5 мкг( нитиДНК фагэ M13LT20 смешива бт с 250 пмоль фосфорипироааниого опигонукпеотида (UI) в 50 мкл буфера L без дИтИртреита и гАТР. смесь нагревают 8 течение 15 мин при 80°С. после чего медленно в течение 3 ч охлаждают до 15°С. затем прибавляют dATP. dGTP и TIP до концентрации 100 мкм каждого и 15 ед. ДНК-полимеразы Е.соН (Фрагмент Кпенова). Смесь инкубируют А ч при 15°С, затем прибавляют гАТР до концентрации 0.1 мМ. дитиотреит до концентрации 10 мМ и 100 ед. Т4 ДНК-Лигазы и продолжают инкубацию при той же температуре еще в течение 10 ч. Пятую часть реакционной смеси (Используют для трансформации компетентных клеток E.cdII WK-6 mutS. описано выше. Скрининг рекомбинантных фагое проводят гибридизацией с 5-1 Р -меченным мутагонизирующим рлйгонуклеотидом (III) в условиях жесткой otмывки (55°С. 2 X SSC). Клетки E.GOli WK-6 must, содержащие гибридизующиеся с зондом фаги, выращивают, из них вмделяйэт репликативную Форму фаговой ДНК и т|Ьд вергают анализу с помощью совместного гидролиза рестриктазами Kpnl+Pstl и Pstl. Рекрмбинантные фаги, содержащие ДНК, нечувствительные к рестриктазе Xhol и,образующие при гидролизе, смесью рестриктаз Крп и ХЬоГ фрагмент величинойЗ42п.о., M13LT21, отбирают для дальнейшей рёботы. Затем выделяют KpnI/HlndlU - фрагмент ДНК этих фагов. реклониру 6г его в плазмиду pTNF3lA по тем же pectpMKtным свойствам, как описано выше, результате получили новую рекомбинантную плазмидную ДНК pLT21. структуру которой подтверждали рестриктным анализом с помощью зндонуклеаз Haelll и Map, а также х)пределением нуклеотидной последовательности плазмиды между сайтами Kpnl и HIndlll.

Плазмида pLT21 детерминирует био-: синтез полипептида, предстаеяяющеш собой укороченный с N-конЦа Hf 21 аминокислоту лимфотоксин человека.,

П р и м е р 4, Получение штамма-продуцента полипептида со свойствами лимфотоксина человека.

Ппазмидой pLT9 гряисформируют компетйитные клетки Е.cell SC 20050 по изяестному методу и получачтт штямм-пролуцент полипептида со соойс. лимфотохсииа В человека. , ;

П ри м е р 5. Определение продуктивности штамма Е.соИ - продуцента полипептида со свойствами лимфотоксина человека..

10 Клетки E.cott SG 20050/PLT21 выращи. вают при э 20 мл LB-бульона в течение 20 ч на качалке при скорости враще1чия 190 об/мин,отбирают пробу 2 мл. клетки центя ифугируют 10 мин при 6000 об/мин, 15 затем суспендируют в 1 мл буфера, содор жащего 25 мМ трис-HCl. рН 8.0, 0.5 мМ фенилметилсульфонилфтормд и 5 мг/мл лизоцим. и инкубируют 30 мин при 25°С. Для вскрытия клеток смесь замораживают в 0 течение 10 мин при , а затем оттаивают во льду; эту операцию повторяют трижды, после чего определяют содержание лимфотоксина 8 растворе измерением его биологической активности.

5 Биологическую активность ЛТ определяют на культуре трансформированных мышиных фибрОбпастов линии L-929. С зтой целью монослойную культуру клеток выращивают в СОа-тёрмостате в 9б-луночныч 0 пластинах для культур клеток в среде ОМЕМ,:СОдержащёЙ 10%-ную сыворотку теленка. Для определения биологической активности культуральную среду заменяют на свежую среду рМЕМ, содержащую 1%-ную 5 сыворотку теленка, актиномицин D (1 мкг/мл) и клеточный лизат в двухкратных серийных разбавлениях {примерно .соответствующих концентрации лимфотоксина от 1 мкг/мл до 10 мкг/мл). Пластины снова 0 инкубируют в течение 16-20 ч в СОг-термоСтате, затем клетки прокрашивают трипановым синим и подсчитывают количество . окрашенных (жизнеспособных) и неокрашенных (живых) клеток. За 1 единицу 5 .активности принимают количество лимфотоксина. вызывающее гибель 50% трансформированных клеток. Таким Образом, предлагаемая группа

изобретений поэаоляет получать новый norf0 ипептид со сбойствайи лимфотоксина человека, причем уровень биосинтеза такого полипептида составляет 2 X 10 ед./мл культуры клеток, что составляет свыше 25% суммарного клеточного белка Е.соИ -при 5 у рощбнной технологии его по учения за счет исключения стадии индукции биосинтеза беяка. Ф о р му л а и зо б р е т е н и я

1. Рекомбйиантиая плазмидная ДНК pLT2t, кодирующая полипептид со свойствами лимфотрксииа человека, мол. м, 2,62 МДа и размером 4,02 т.п.о.. содержащая

HlndlU-Kpnl - фр1гмеит ДНК плазмиды PTNF31 с тандемом промоторов А2 и. A3 рймней области бактериофага Т7 терминатором транскрипции фага лямбда, геном/ -лактамазы и геном хлорамфениколацётилтрансферазы размером 3,4 т.п.о,,

Kpnl-Hlndltl - фрагмент с синтетическим сайтом инициации трансляции и му; тантным геном пимфотоксина человека, кодирующим аминокислотную последова тельность лимфотоксина чeлoвeкia,y которого делетирована 21 М-концевая аминокислота, размером 0,63 Т.П.О.,

генетические маркеры:

ген/ -лактамазы - ген устойчивости к пенициллиновым антибиотикам,

ген Сш - ген устойчивости к хлорамфениколу:

уникальные сайты узнавания рекстрикционных эндонуклеазами, расположенные на следующих расстояниях вправо от сайта KpnhGSU 129 нуклертидов. Sail- 618 нуклёотидой, HIndtll - 630 нуклеотидов. NCOI 1181 нуклеотид, Ndel - 1955 нуклеотидов.

U. Штамм бактерий Escherlchla соН ВКПМ 8-5279 - продуцент полипептида со 15 сво{ ствами лимфотокеина человеке.

Изобретение относится к биоте)(:ноло- гии, в частности к генетической инженерии, и позволяет получать микробиологическим синтезом новый полипептид со свойствами лимфотоксина человека при упрощеннойтехнологии его получения. Целью изобретения является повышение выхода пслипеп- тида со свойствами лимфотоксина человека. Создана новая рекомбинаитйая плазми.аа pLT21, кодирующая полипептид, представляющий собой укороченный на 21 амино" кислотный остаток лимфотоксин человека и штамм Е.соП 20050/pLT21, обеспечивающий высокий уровень биосинтеза полипептида со свойствами лимфотоксина человека. Рекомбинантн'ая пла'змида pLT2T содержит полусинтетичёский ген полипептида со свойствами лимфотоксина человека. Она состоит из Hind 1П Крп1 - фрагмента плазмиды pTNF31, содержащего тандем промоторов транскрипции А2 и A3 ранней области бактериофага 17, Терминатор трг.н.'.крипции фагаАи гены^-лактамазы и хлорамФенико- дацетйлтрансферазы. и Kpnl/Hind III -фрагмента, содержащего синтетический участок инициации трансляции и мутантный геном лимфотоксина человека. Штамм Escherichla coli SG.20050/pLT21 обеспечивает высокий уровень биосинтеза полипептида со свойствами лимфотоксина человека и упрощенной технологией его выделения. 2 с.п, ф-лы, 2 ил„

..... . . : , . , . . .- -11

.fMet Tal Arg Зет Ser Бег ila

м СС5ЕАС(Я АМШ МА ШААСгСА га АОА ТСС ТОО AGO ОТ GCC

.. -.. - -20 ;.../.- .VV.. . .. о . Oltt 5Ito Ala Arg Gin His гО lys Met His Leu Ala Hie Ser Thr beu,.. Ш ACT 000 OQT CAG CAC CtiC AAG АФО CAO СИ GCC ОАО AGO AAC CTC...

imWCCCAOAOTGOOGGfCAGO .. ,((ГГАААТТФАААТ Ш1& CTU60CCACAOCAACGTC...

AAlfAQCAAaiAC-GAACGGGfGTCGT

- . , . (т) .

%1P

t

(И

Ai