Способ определения активности антитромбина III Советский патент 1990 года по МПК G01N33/86 

Изобретение относится к области медицины и касается определения активности основного ингибитора системы свертывания крови, антитромбина III.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Способ осуществляют следующим образ ом о

Для осуществления способа необходимы следующие реагенты.

Тромбин 20 ед NIH/мл в 0,15 NaCl. Заготовленный раствор тромбина активностью 100 ед NIH/мл хранят в сили- конированных флаконах при температуре - 20°С, перед употреблением разводят 0,15 М NaCl до требуемой активности.

Фиброноген 10 г/л в О,5 М NaCl (достаточно 5 мл) готовят перед ис- следованием.

0,5 М раствор NaCl для разведения реагентов„

Контрольная бестромбоцитарная плаз- плазма - это замороженный пул плазмы от 10 доноров. Хранят его во флаконах по 1 мл, при температуре -20 С в течение 1 года (без снижения активности антитромбина III). Перед употреблением плазму размораживают и раз- , водят 0,15 М NaCl в 10 раз, получая 10%-ную контрольную плазму.

Стабилизатор (0,15 М NaCl, содержащий тринатрийцитрат в конечной концентрации 0,05 М).

СП

&

N

S

«о

Способ осуществляется следующим образом.

Путем прокола копьем мякоти пальца пациента набирают в микропипетку О,1 мл капиллярной крови и вносят в силиконированную пробирку с 0,7 мл стабилизатора, перемешивают и центрифугируют при 300 g в течение 5 мин Берут также кровь для получения зна- чения гематокрита плазмы (у) по обычной методике.После центрифугирования из пробы берут 0,5 мл опытной плазмы неизвестного разведения и определяют в ней активность антитром бина III по известному способу,,

В силиконировэнные пробирки с 0,5 мл 10% исследуемой контрольной и опытной неизвестной концентрации плазм добавляют 0,5 мл раствора тром бина. Смесь инкубируют на водяной бане при 37 С и на первой минуте инкубации встряхивают несколько раз для образования малообъемного сгустка фибрина, который можно удалить. На 4,6,8,11 и 14 мин инкубации 1;цнк смеси О,1 мл образовавшейся сыворотки берут пипеткой и добавляют в пробирки с 0,1 мл раствора фибриногена. По секундомеру регистрируют время свертывания t фибриногена остаточны

fJ

тромбином сыворотки (забор сыворотки может быть и при других значениях t , но не более 18 мин).

Расчет активности антитромбина III производят по калибровочной кривой по известной методике.

Для построения кривых скорости инактивации тромбина антитромбином III контрольного и опытного образ- цов плазмы на миллиметровой бумаге из полученных в секундах значений t c извлекают десятичный логарифм Igt c. Кривые скорости инактивации тромбина антитромбином строят для контрольного и опытного образцов плазмы в координатах lgtc (на оси ординат), tUHK (на оси абсцисс).

Для вычисления активности антитромбина III в опытном образце вна- чале совмещают начальные точки кривых (если они не совпадают ) с соблюдением угла их наклона, чем вносят поправку на различное содержание антитромбина I в образцах плазмы и коррегируют ошибку отмеривания образцов р

Любую точку на кривой скорости инактивации тромбина антитромбином

III контрольного образца плазмы принимают за 100% активности антитромбина III. Такая точка взята на 10 мин инкубации смеси. К ней соотносят T04Ky(tUHK 10 мин) на кривой для опытного образца плазмы капиллярной крови и получают промежуточное значение активности антитромбина III капиллярной крови (х). Окончательное значение активности антитромбина III капиллярной крови рассчитывают,учитывая полученное ранее значение гематокрита плазмы (у) по формуле: активность антитромбина III капиллярной

крови 0,1 У (-) „

У

Пределы нормальных колебаний активности антитромбина III капиллярной крови, определенные для донорской группы (20 чел.)составляют 94- 146% (х ± 26); 120±2,9% (x±S).

Пример 1. У пациента 1 исследовали капиллярную кровь предлагаемым способом в динамике (t инк 4,6, 8,11 и 14 мин) и получили значения tc 43, 60, 81, 129, 205 с и значения lgtc 1,633; 1,778; 1,908; 2,111 и 2,312 соответственно, Для построения калибровочной кривой исследовали контрольную 10%-ную плазму при тех же значениях t инк , получили t c 37, 49, 66, 102 и 157 с и соответственные значения Igtc 1,568, 1,690 1,820, 2,009, 2,196.

По полученным значениям lgtc строят кривые для контрольного образца плазмы (k) и для исследуемого образ- ца пациента 1 (П . После совмещения начальных точек кривых опытного и контрольного образцов и соотношения точек кривых, взятых на 10 мин инкубации, найдено, что промежуточное значение активности антитромбина III (х) равно 106%0 Значение гематокрита плазмы (у) пациента 1 равно 0,5. Окончательное значение активности антитромбина III капиллярной крови с учетом разведения плазмы опытного образца получают при использовании формулы: активность антитромбина III капиллярной крови у пациента 1 равно

0,1х(-) 159%, что выше нормы.

П р и м е р 2„ При исследовании проб капиллярной крови у пациентов 2 и 3 в динамике (tUHK 4,6,8,11 и 14 мин) получены одинаковые значения tc 31,38,46,63,86 с и соответственно им значения Igt 1,491; 1,580-, 1,663, 1,799 и 1,934. Однако гема- токрит плазмы у пациента 2 равен 0,5, у пациента 3 - 0,57. Внося поправку на различную концентрацию исследуемой плазмы капиллярной крови пациентов 2 и 3 путем подстановки зн значений гематокрита плазмы в формулу, получаем: активность антитромбина III капиллярной крови пациента 2

равна 0,Ь70 () 105%, что укладывается в пределы нормы; у пацен- та 3 равна 0,01-70 () 93%, 5

что ниже нормы.

По известному способу определение активности антитромбина III(AT-III) осуществляют в плазме крови без уче- та гемоконцентрационных сдвигов. В сосудистом русле кровь осуществляет свои функции, в частности гемостати- ческие, действуя всем своим объемом. Антитромбин III содержится в плазме крови, объемная доля которой различная в разных образцах крови. Не будет поэтому полного соответствия между выявляемой активностью антитромбина III в плазме крови и его истин- ной активностью в единице объема крови без учета объемной доли плазмы кровч.

С целью повышения точности заявляемого способа исследование прово- пят в плазме капиллярной крови, дополнительно определяют объемную долю плазмы, активность антитромбина III без учета объемной доли плазмы и рассчитывают в процентах активность анти тромбина III по формуле AT-III

d-L.1

у

тивности антитромбина III без учета объемной доли плазмы, у - объемная доля плазмы крови.

В таблице приведены конкретные данные определения активности антитромбина III в группе (21 человек) практически здоровых доноров. Функ- циональная активность антитромбина III определялась в плазме крови по известному способу без учета объемной доли плазмы и в тех же образцах по предлагаемому способу.

Учитывая выявленные ошибки определения активности антитромбина III в пробах по известному способу (таблиц ца), найдено, что в среднем на 7,35%

0,1х (-), где х - значение ак

заявляемый способ точнее в сравнении с известным. Формула изобретения

Способ определения активности антитромбина щ путем стабилизации и разведения крови, центрифугирования , добавления тромбина с активностью 20 ед/мл с последующим определением активности антитромбина III в динамике, отличающий- с я тем, что, с целью повышения точности способа, исследование проводят в плазме капиллярной крови, дополнительно определяют объемную долю плазмы, рассчитывают активность антитромбина III без учета объемной доли плазмы по формуле

,1

AT III (%) -0,1х (где AT III - активность антитромбина III, 0,1 - объем капиллярной крови;

х - значения активности AT III без учета объемной доли плазмы;

у - объемная доля плазмы;

7 - коэффициент разведения.

римечание.

Плюс (+) - результат завышен; минус (-) - результат занижен.

Изобретение относится к медицине и касается определения активности основного ингибитора системы свертывания крови, антитромбина III. Целью изобретения является повышение точности способа определения активности антитромбина III. Цель достигается тем, что определение активности антитромбина III в капиллярной крови осуществляют способом-прототипом, с последующим определением показателя гематокрита плазмы (Y). Конкретное значение активности антитромбина III капиллярной крови без учета разведения плазмы и гематокрита плазмы (Y) используют для расчета окончательной активности антитромбина III капиллярной крови по формуле 0,1X ^. (7 + Y)/Y, где X - значение активности антитромбина III без учета объемной доли плазмы

Y - объемная доля плазмы

7 - коэффициент разведения. Изобретение позволяет определять активность антитромбина III в капиллярной крови и существенно повысить точность способа. 1 табл.