Способ определения количества и консистенции сырой биомассы Советский патент 1990 года по МПК G01N24/08 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано в медицинской, микробиологической и пищевой промышленности при производстве бактериальных препаратов.

Цель изобретения - повышение точ ности определения количества и консистенции сырой биомассы.

Сущность изобретения заключается в том, что сокращаются времена т, и Тг ЯМР-релаксации протонов внеклеточной воды при добавлении в суспензию клеток парамагнитного вещества,не проникающего в клетки.Это дает возможность разделить сигналы протонов внутри- и внеклеточной воды.Высокая проницаемость клеточных мембран приводит к быстрому обмену молекулами воды между внутри- и внеклеточным объемами, что изменяет амплитуды быстрой (внекпеточной) и медленной (внутриклеточной) компонент

сигнала ЯМР-релаксации и не позволяет точно определить количество воды вне и внутри клеток. Повышая концентрацию парамагнитного вещества во внеклеточном объеме, можно значительно сократить время релаксации внеклеточных протонов и выполнить измерение амплитуд сигналов ЯМР за время более короткое, чем время обмена молекулами воды через мембрану. На фиг.1 показаны типичные релаксационные кривые для суспензий клеток микроорганизмов разных концентраций; на фиг. 2 - зависимость времени релаксации внеклеточных протонов тгй, отношение Т2а/Т2в времени релаксации внутриклеточных протонов к времени релаксации внеклеточных протонов и амплитуды Ря сигнала протонов и внутриклеточной воды клеток дрожжей Sacharomycer- cerevisiae . от концентрации парамагнитных ионов

Мп

24в суспензии клеток.

Затем исходный образец клеточной биомассы разбавляют в N раз (N 2-5) питательной средой или изотоническим физраствором, содержащими парамагнитное вещество в той же концентрации и измеряют амплитуду сигналов Раг и РВ1 внутри и внекпеточ- ной воды.

Для величин РП1 и Р

си

Bi

можно записать следующие соотнощсния:

Р

9,

E 1 ,. . 1 (°

где I

количество внутриклеточной воды в исходном образце клеточной биомассы, а Е-4 - количество внеклеточной воды в этом, образце. Аналогичные соотношения можно записать для величин Р. и Р„ .

QЈv4

I

.-.

E,

7

Eji l + E

(2)

Изобретение относится к биотехнологии и направлено на повышение точности определения количества и консистенции сырой биомассы. В ампулу для ЯМР-анализа заранее вводят 5-50 мкл концентрированного раствора парамагнетика, не проникающего через клеточные мембраны. Затем в ампулу отбирают образец клеточной суспензии и тщательно перемешивают. Ампулу помещают в датчик ЯМР релаксометра и регистрируют релаксационное изменение амплитуды сигнала ЯМР. Полученную кривую разлагают на сумму двух экспонент быструю и медленную, связанных с релаксацией протонов вне- и внутриклеточной воды, и находят начальные амплитуды этих компонент P_в1 и P_а1. Затем исходный образец разбавляют в N раз (N=2÷5) питательной средой или физраствором, содержащим парамагнитное вещество в той же концентрации и вновь измеряют амплитуды сигналов P_а2 и P_в2 внутри- и внеклеточной воды. По полученным величинам рассчитывают содержание C сухого вещества биомассы и количество внутриклеточной J и внеклеточной E воды в образце C=P_а1-NP_а2)/(P_а1^.P_в2-NP_б1^.P_а2)

J=P_а1/(1+C)

E=P_в1/(1+C)

количество B сырой биомассы и ее консистенцию K находят по формулам B=C+J)/C+J+E)

K=B/E. 2 ил.

Способ осуществляют следующим образом

В ампулу для ЯМР-анализа заранее вводят каплю (5-50 мкл) концентрированного (0,1- 1М) раствора парамагнетика, как правило MnCla, затем отбирают образец клеточной суспензии (0,5-1,0 мл) помещают в ампулу и тщательно перемешивают для равномерного распределения парамагнетика по объему образца. Далее ампулу помещают в датчик ЯМР-релаксатора и регистрируют релаксационное изменение амплитуды сигнала ЯМР с помощью одной из известных импульсных последовательностей, например, 90-180 ,„. 180 (тг) или 180-90° (Т)0 Полученную кривую разлагают на сумму двух экспоненциальных компонент и определяют их начальные амплитуды PQI и PBl .Как следует из Лиг.2, при концентрации МпС1г больше, чем 10 мМ Ра практически постоянна и соответствует доле внутриклеточной воды в образце суспензии При этом времена ЯМР-релак- сации внутри и внеклеточных протонов отличаются более чем в 20 раз (тга/ /Т56Ь20). Таким обр аз ом, введение в анализируемый образец парамагнетика в концентрации, обеспечивающей 20-кратное различие времен релаксации быстрой и медленной компонент сигнала ЯМР, обеспечивает точное измерение амплитуд этих компонент.

где F,a - количество внеклеточной воды в образце, разведенном N раз питательной средой или физраствором.

С учетом того, что Е2 (,). N, где С - количество сухого остатка после высушивания клеточной биомассы, из (1) и (2) следует:

С .Pa,

ьР Р - NP Р

a, Kfea И1в, vaii

1+С

F

Ь

P.BL 1+С

40

По полученным С, I и Е, находим количество сырой биомассы

В

с + I +

Е

и консистенцию сырой биомассы К

I Е

JB

Е

Пример 1. Определение количества и консистенции сырой биомассы пекарских дрожжей.

Пробу клеточной суспензии дрожжей, объемом 0,5 мл с помощью пипетки переносят в ампулу для ЯМР-изме- рений, в которую предварительно внесено 10 мкл 500 мМ раствора МпС12 .в воде и перемешивают. Методом Кар- ра-Парселла на приборе Миниспекирс- 20 измеряют времена релаксации (Т2а ,тгВ) и амплитуды компонент

(р , P. ) сигнала ЯМР внутри и

4 0| В(

внеклеточных протонов воды. В данном случае они составили Т2а 27 мс,

„в 1,8 мс,

Я|

0,44, РЪ,

Т,

0,56.

Затем в ампулу дополнительно вводят 0,5 мл физраствора с 20 мкл 100 мМ МпС12 так, чтобы объем пробы увеличился вдвое (N 2) и снова производят ЯМР-измерения. В результате получилось T2fl( 24 мс, 1,5 мс V 0,20, рвг 0,80.

Подставляя эти значения Ра ,РВ и N в формулы, получаем

0,44 0,8-2-57557о720

0,313 г/мл;

т „ -Q

1,313

0Л56 I,313

.

l + С

0,43;

0,603 г/л;

К -Ј- 1,414,

Пример 2„ Аналогично примеру 1 определяют значения Рд, Р6 и T2(J , Т2б неразбавленной клеточной суспензии. Получают Ра П,44,Ер - 0,56, Т2С1 27 мг, тг& 1,8 мг. Затем исходную суспензию разбавляют в 5 раз (N 5). Для этого к 0,5 мл суспензии клеток добавляют 2 мл физрастгора с 40 мкл 500 мМ раствора МпС1г. Отбирают пробу 0,5 мл в ЯМР-ампулу и измеряют

РП« i РП Т Оп И Т„

m Р т

83 2а а, 0,075, Рвэ

IB

1а 28 мс, Т2Ь Следовательно

Они составляют

0,925,

1,6 мс.

Ог4А-5 0А075

О,,925-5-0,56/0,075

0,325, тогда

В 0,6 и К 1,41, что практически совпадает с результатами предыдущего измерения (при N 2).

Пример 3. Определение гема- токрита и консистенции донорской крови человека.

15662746

В случае, когда содержание сухого вещества в клетках известно эара0

5

0

5

нее, процедура определения количества и консистенции клеточной суспензии упрощается. Клетки крови человека в среднем содержат 71% воды и 29% сухого вещества, т.е. ,29(4). Для определения гематокрита (количества клеток) предлагаемым методом достаточно измерить Pq и Ре неразведенной пробы крови, причем для анализа достаточно капли крови объемом 100-200 мкл. В качестве примера 10 мкл МпС12 100 мМ концентрации вводят в ампулу для ЯМР-измерений, затем добавляют 200 мкл консервированной крови человека и тщательно перемешивают, затем,с помощью ЯМР-ре- лаксометра определяют Рд и Р-а С учетом 5%-го разбавления раствором парамагнетика, их значения оказались равны соответственно Ра 0,31,Рв 0,69.

Поскольку С выражено в процентах (долях) к сырому весу клеток крови, то определение гематокрита (Г) и консистенции (К) крови сводится к вычислению выражений

Г

.Ра т сР,

0А31

lzO,29-0,69

0,39;

35

К

0,69

Полученные результаты совпадают с известными данными, где используется метод центрифугирования с поправкой на интерстициальную воду В то же время предлагаемый способ значительно экспресснее (5 мин) и требует меньшего количества крови.

Формула изобретения

Способ определения количества и консистенции сырой биомассы путем измерения объемов пнутриклеточной I и внеклеточной Е воды соответственно, содержания сухого вещества С в образце и расчета количества В сырой биомассы и ее консистенции К по формулам

С

с

+ I +

В

В/Е,

отличающийся тем, что, с целью повышения точности, в образец вводят парамагнитное вещество в концентрации, обеспечивающей различие времен ЯМР-релаксации протонов внутри- и внеклеточной воды не менее, чем в двадцать раз, методом ЯМР-релаксации измеряют амплитуды сигналов Р и РВ| внутри- и внеклеточной воды соответственно, разбавляют образец в 2-5 раз питательной средой

4

или изотоническим физраствором,содержащими парамагнитное вещество в той же концентрации, измеряют амплитуды

сигналов Р01 и Р

в

внутри- и внеклеточной воды, а величины I, E и С определяют по формулам

„ESJ. - .

10

PQ,- P6l - MV

гаг

т Pai. р , . и-с 1+с

где N - кратность разведения.