Способ определения осмотических свойств клеточных мембран Советский патент 1986 года по МПК G01N24/08 

1

Изобретение относится к физическим методам исследования вещества на основе явления ядерного магнитного резонанса и может быть использовано в микробиологической и пищево промьшшенности, медицине, биологии и других областях естественных наук, где необходимо проводить быстрый и точный контроль осмотических свойств клеточных и везикулярных мемран, а также полупроницаемых замкнутых оболочек.

Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способа и сокращение времени анализа.

Сущность способа заключается в следующем.

Измеряют амплитуду сигнала ЯМР от протонов воды М образца суспензии клеток в исходном состоянии (при исходной осмоляльности внеклеточной среды) и одном выбранном значении температуры,, переводят клетки этого образца с сохранением их количества из исходного состояния в исследуемое (к исследуемой осмоляльности внеклеточной среды), добавляют во внеклеточный объем парамагнитное вещество низкой концентрации (5 - 7 ммоль) и измеряют в этом состоянии при одном выбранном значении температуры среднее время жизни t молекул воды в клетках и амплитуду сигнала 5ШР от протонов внутриклеточной воды Мд.

Далее аналогичные онерации проделывают для серии из исследуемых значений внеклеточной осмоляльно сти. Таким образом, в предлах аемом способе исключается операция измерения температурной зависимости L при каждом значении исследуемой внеклеточной осмоляльности, что значительно сокращает затраты времени. Если количество клеток во всех исследуемых состояниях одинаковое, то отношение М./М I для всех i 0,1,...,N, где М . и - амплитуды сигналов

hi В

ЯМР R одном из исследуемых: и исходном состояниях образца. По измеренным значениям д и М ; и М и известным формулам оценивают изменения внутриклеточного об.ъема V образца и определяют диффузионную водную проницаемость (ДВП) клеточных мембран.

Способ осуществляют следую11щм образом.

Часть исходной суспензии клеток (объемом 0, - 0,2 мл) тгомещают в

246932

ЯМР-ампулу, измеряют амплитуду М сигнапа ЯМР от протонов воды. Затем клетки образца перез-юдят в одно из исследуемых состояний при добавлении парамагнитного вещества в таком количестве, чтобы его концентрация во внеклеточном растворе не превышала 5-7 ммоль. Измеряют по точкам кривую спада поперечной намагниченности

д М, которую можно разложить на сумму трех экспонент с параметрами: l , с т;,, М; и , М , где м;, М , М - амплитуды отдельных компонент соответственно, а Т - длин- JJ нов, Т у - короткое, - промежуточное время поперечной релаксации. Первая группа параметров (Т. , М ) относится к протонам внутриклеточных структур и мембран клетки, т.е.

к твердому телу, поэтому Т значительно короче времени Tj, и Т , каждая из двух остальных компонент характеризует протоны внутри- и внеклеточной воды.

Дапее при том же исследуемом значении внеклеточной осмоляльности готовят образец для измерения в нем времени релаксации протонов внутриклеточной Т или внеклеточной

- воды. Используя значения Т;, М, , М и Т или и выражения для двухфазной системы ядерных спинов с обменом намагниченности между фазами, определяют одновременно среднее время жизни молекул воды в клетках t д и относительное количество (долю) внутриклеточной воды Р для каждого исследуемого состояния образца.

Амплитуду Я (з сигнала ЯМР, соответствующую протонам внутриклеточной воды в исследуемом состоянии образца, определяют из соотношения М Р( (М + Мр . Далее проделывают такие же операции для каждого значения исследуемой внеклеточной осмоляльности. Исходное состояние образца принимают за контрольное.

По измеренным значениям амплитуд сигна.пов и по известным формулам оценивают изменения внутриклеточного объема Vj исследуемых состояний, а затем определяют диффузионную водную проницаемость клеточных мембран по отношению к исходному состоянию об разца.

Пример. Определение относительных значений количества внутриклеточной воды и диффузионной водной

5

проницаемости эритроцитарных мембран от величины осмоляльности внеклеточной , создаваемой хлористым натрием, при + 5 С,

Кровь объемом по 0,1 - 0,2 л разливают в две ЯМР-ампулы (1 и Г ), измеряют амплитуду М 11,7+0,1 сигнала поперечной намагниченности М протонов воды в образце 1. Амплитуда сигнала ЯМР измерена в условных единицах. Затем к образцам 1 и Г добавляют по 3 мл водного раствора хлористого натрия, например, осмоляльностью П 0,28 .осм. Б образец 1 добавляют дополнительно 25 мкл водного раствора МпСГ исходной концентрации 0,5 моль с целью чтобы его конечная концентрация бьта менее 5 ммоль. Образцы выдерживают в солевом растворе 30 мин. Затем эритроциты образца 1 осаждают 1 мин при 1600 g (,8 м/с), суперна- тант отбирают в таком количестве, чтобы объем оставшейся суспензии был равен 0,1 - 0,2 мп. Эритроциты образца 1 осаждают 40 мин при 1600 g, супернатант полностью отбирают.

Методом Карра-Парселла-Мейбума- Тилла (КПМГ) измеряют время спинспи- новой релаксации ,9+2мс протонов внутриклеточной воды в,плот- ноосажденных эритроцитах образца 1 и тем же методом - параметры кривой М (Т,, 24,1 ± 0,5 мс, М1 3,57± ± 0,03, Tgg 2,44 ± 0,06 мс, М 6,28 + 0,06, т; 0, 0,01 мс, М 0,91 + 0,01) суспензии эритроцитов образца 1, Соответствующая протонам гемоглобина и мембран компонента ( И ) спада М в расчетах не учитывается.

На основе параметров .а. чВ а Mr, Tj вычисляют одновременно среднее время жизни молекул воды i в клетке и долю внутриклеточной воды Р в суспензии клеток образца 1. Эти величины равны 1а 33,8 ± 0,8 мс, Р 0,313 + 0,005. Находят амплитуду протонов внутриклеточной воды М, Рд (М + П) 3,08 + 0,05. Таким же образом определяют аналогичные параметры образцов с разным осмотн,- ческим давлением внеклеточной среды и по известн лм формулам - относительные величины количества внутриклеточной воды и ДВП эритроцитарных мембран в i-м исследуемом состоянии образца относительно его ис- ходного состояния, за которое принята осмоляльность П 0,28 осм внеклеточного раствора хлористого натрия , близкая к изотонической осмоляльности плазмы крови. Изменение коли- чества внутриклеточной воды в эритроцитах в координатах Вант-Гоффа (V - ) описывается линейной зависимостью с коэффициентом наклона К 0,246.

Таким образом, в исследуемой области осмоляльностей эритроцитарная мембрана проявляет идеально упругие свойства, т.е. ведет себя как идеальный осмометр. ДВП эритроцитарной

мембраны остается постоянной вблизи изотонической точки и возрастает с увеличением и уменьшением осмоляльности внеклеточной среды. Следовательно, энергетический барьер для

трансляционной диффузии молекул воды через эритроцитарную мембрану минимален вблизи изотонической осмоляльности.

30

Формула изобретения

5

Способ определения осмотических свойств клеточных мембран, включающий измерение среднего времени t жизни молекул воды в клетках образца методом ядерного магнитного резонанса (ЯМР) с добавлением во внеклеточный объем образца парамагнитного вещества низкой концентрации, о т л и ч а- 0 ю щ и и с я тем, что, с целью расширения функциональных возможностей и сокращения времени анализа, измеряют отношения начальных амплиту-т сигналов ЯМР от протонов внутрикле- точной воды образца в исходном и исследуемых состояниях, получаемых при добавлении нескольких порций парамагнитного вещества, по измеренным отношениям судят об изменениях внутриклеточного объема У исследуемых состояний и по значениям t и V определяют диффузионную водную проницаемость клеточных мембран по отношению к исходному состоянию образца.

Изобретение относится к исследованию вещества методом ЯМР и может быть использовано для контроля осмотических свойств клеточных и везикулярных мембран, а также полупроницаемых замкнутых оболочек. Цель изобретения - расширение функциональных возможностей способа и сокращение времени анализа. Сущность способа заключается в следующем. Измеряют амплитуду сигнала ЯМР от протонов воды образца суспензии клеток в исходном состоянии, переводят клетки этого образца с сохранением их количества из исходного состояния в исследуемое, добавляют во внеклеточный объем парамагнитное вещество низкой концентрации и измеряют среднее время жизни молекул воды в клетках и амплитуду сигнала ЯМР от протонов внутриклеточной воды. Далее аналогичные операции проделывают для серии исследуемых образцов. сл ND ГО 4 05 СО со